[發(fā)明專利]利用通過核酸外切酶和核酸內(nèi)切酶二者切割的寡核苷酸探針進(jìn)行的核酸檢測

無效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201380030396.8
• 申請日: 2013-05-01
• 公開（公告）號: CN104350160A
• 公開（公告）日: 2015-02-11
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 李俊;張文騰;詹森·歐普迪克;約翰·哈爾威;鄭成春
• 申請（專利權(quán)）人: 三星泰科威株式會社
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;C12N15/11
• 代理公司: 北京銘碩知識產(chǎn)權(quán)代理有限公司 11286
• 代理人: 劉燦強(qiáng);譚昌馳

1.一種檢測試樣中的目標(biāo)序列的方法，所述方法包括：

(a)擴(kuò)增試樣中的目標(biāo)序列以產(chǎn)生增加數(shù)量的目標(biāo)序列的拷貝，擴(kuò)增包括：將第一引物和第二引物雜交到試樣中的目標(biāo)核酸以獲得目標(biāo)核酸和引物的雜交產(chǎn)物，以及利用依賴模板的核酸聚合酶來延伸雜交產(chǎn)物的第一引物和第二引物以產(chǎn)生延伸引物產(chǎn)物；

(b)將延伸引物產(chǎn)物雜交到至少一個探針寡核苷酸，以獲得延伸引物產(chǎn)物:探針寡核苷酸的雜交產(chǎn)物，其中，探針包括5’-DNA序列和RNA序列，并且結(jié)合到可檢測標(biāo)記；

(c)使延伸引物產(chǎn)物:探針寡核苷酸的雜交產(chǎn)物接觸RNase?H和核酸外切酶活性，所述RNase?H和核酸外切酶同時存在；

(d)檢測由探針上的標(biāo)記所發(fā)射的信號的增強(qiáng)，

其中，信號的增強(qiáng)表示試樣中存在目標(biāo)序列，并且所述信號的強(qiáng)度與在缺少RNase?H時執(zhí)行的相同檢測方法所獲得的信號強(qiáng)度相比要高1％或更多。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中，探針結(jié)合到熒光共振能量轉(zhuǎn)移對，熒光共振能量轉(zhuǎn)移對中的一個結(jié)合到探針的3’端，熒光共振能量轉(zhuǎn)移對中的另一個結(jié)合到探針的5’端。

3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中，利用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)的方法來完成擴(kuò)增。

4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中，同時地或順序地進(jìn)行擴(kuò)增、雜交和接觸。

5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，所述方法還包括：

在擴(kuò)增之前在富集培養(yǎng)基中培養(yǎng)包含目標(biāo)序列的試樣，以加強(qiáng)包含目標(biāo)序列的病原體的生長。

6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中，目標(biāo)序列是RNA。

7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其中，所述方法還包括產(chǎn)生目標(biāo)RNA序列的互補DNA序列的步驟。

8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中，目標(biāo)序列是DNA。

9.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中，核酸外切酶活性源于DNA聚合酶。

10.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中，RNase?H是RNase?HII。

11.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中，RNase?H是熱穩(wěn)定的。

12.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中，所述方法包括從步驟(a)到步驟(d)的多次循環(huán)，并且每次循環(huán)包括指數(shù)期、線性期和平穩(wěn)期，

其中，在平穩(wěn)期測量的信號強(qiáng)度與在缺少RNase?H時執(zhí)行的相同方法的平穩(wěn)期的信號強(qiáng)度相比要高1％或更多。

13.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中，探針具有5’-DNA-RNA-DNA的結(jié)構(gòu)。

14.根據(jù)權(quán)利要求12所述的方法，其中，RNA序列具有1至10個核苷酸。