[發明專利]生產型細胞系的增強子

有效

• 申請號: 201380028164.9
• 申請日: 2013-05-29
• 公開（公告）號: CN104350068B
• 公開（公告）日: 2019-12-03
• 發明（設計）人: 陳剛;D·布拉科夫;D·德施潘德
• 申請（專利權）人: 瑞澤恩制藥公司
• 主分類號: C07K16/00
• 分類號: C07K16/00;C12N15/79
• 代理公司: 11038 中國國際貿易促進委員會專利商標事務所
• 代理人: 袁泉<國際申請>=PCT/US2013/

本發明涉及在生產型細胞中異位表達EDEM2從而改善有用的多亞基蛋白質的產率的發現。因此，本發明提供了包含編碼EDEM2的重組多核苷酸的生產型細胞系，例如經典的哺乳動物生物制藥生產型細胞—CHO細胞。此外，本發明還公開了包含EDEM2的編碼多核苷酸以及XBP1的編碼多核苷酸的生產型細胞。也公開由這些細胞系生產的抗體的改善效價以及培養中由這些細胞得到的改善的細胞密度。

相關申請的交叉引用

根據35U.S.C.§119(e)，本申請要求2012年5月29日提交的美國臨時專利申請號61/652,549的權益，該申請的全部內容明確地以引用方式并入本文。

技術領域

本申請涉及一種或多種細胞，其表達用于改善地生產多亞基蛋白質的重組應激反應凝集素。具體而言，本發明提供了包含編碼EDEM2的基因的哺乳動物細胞及由其衍生的細胞系，并且其產生高效價的抗體。

背景技術

制造治療活性的蛋白質需要在分泌之前進行適當的折疊和加工。適當的折疊與蛋白質(例如抗體)尤其相關，所述的蛋白質由多個亞基組成，這些亞基在分泌之前必須適當地組裝。真核細胞適應這樣的系統，該系統確保蛋白質適當地折疊，并除去分泌途徑中錯誤折疊的蛋白質。該系統被稱為未折疊蛋白質反應(UPR)途徑，并且由錯誤折疊的蛋白質在內質網(ER)中的累積所引發。

UPR的早期事件是轉錄因子Xbp1的激活，其依次激活內質網降解增強α-甘露糖苷酶-樣蛋白質2(EDEM2)的轉錄，而該內質網降解增強α-甘露糖苷酶-樣蛋白質2為內質網相關性降解(ERAD)途徑的成員。EDEM2促進了錯誤折疊蛋白質的去除。ERAD途徑包含5個步驟：(1)分子伴侶介導的對畸形蛋白質的識別；(2)使畸形蛋白質靶向與EDEM2有關的逆向轉運機制或E3連接酶；(3)逆向轉運的引發；(4)泛素化及進一步逆向轉運；以及(5)蛋白體靶向及降解。

抗體為包含兩條重鏈和兩條輕鏈的多亞基蛋白質，其必須適當地折疊并結合從而形成功能異四聚體。為了改善功能抗體異四聚體的產率或效價，對重鏈和輕鏈的高效和精確加工的任何改良以都是需要的。

發明概述

本申請人驚奇地發現，在制造蛋白質的細胞系中，EDEM2的異位表達增加蛋白質的平均產量/細胞，增加被分泌至培養基中的蛋白質的效價，并增加生產型細胞系的積分細胞密度。

因此，在一個方面中，本發明提供了細胞，其包含(a)編碼應激誘導的甘露糖結合凝集素的重組多核苷酸和(b)編碼多亞基蛋白質的多核苷酸。在一些實施方案中，應激誘導的甘露糖結合凝集素為EDEM2蛋白質，其非限定性的實例在表1中提供，并且多亞基蛋白質為抗體。在其他的實施方案中，所述的細胞還包含編碼活性剪切形式的XBP1的多核苷酸，其非限定性的實例在表2中提供。在一個實施方案中，所述的細胞為哺乳動物細胞，例如在生物制藥制造中使用的CHO細胞。

在另一個方面中，本發明提供了由在上一方面中所述的細胞衍生的細胞系。“由……衍生”的意思是指由單個細胞以克隆方式遺傳并具有一些所選的品質的細胞群體，例如生產給定效價的活性蛋白質的能力或增殖至特定密度的能力。在一些實施方案中，所述的細胞系能夠生產效價為至少3克/升培養基(g/L)、至少5g/L或至少8g/L的多亞基蛋白質，其中所述的細胞系衍生自容留編碼應激誘導的甘露糖結合凝集素的重組多核苷酸和編碼多亞基蛋白質的多核苷酸的細胞。在一些實施方案中，與由基本相同的細胞衍生的但不具有編碼應激誘導的甘露糖結合凝集素的重組多核苷酸的細胞系所獲得的積分細胞密度相比，所述的細胞系可以獲得高至少30％、至少50％、至少60％或者至少90％的積分細胞密度(ICD)。