[發明專利]使用有機溶劑中的枯草桿菌蛋白酶的側鏈被保護的寡肽片段縮合

無效

• 申請號: 201380022510.2
• 申請日: 2013-02-28
• 公開（公告）號: CN104284901A
• 公開（公告）日: 2015-01-14
• 發明（設計）人: 彼得·賈恩·萊納德·馬里奧·庫埃迪弗利艾格;蒂莫·努伊金斯
• 申請（專利權）人: 恩細貝普有限公司
• 主分類號: C07K1/02
• 分類號: C07K1/02;C07K1/04;C07K7/06;C07K7/08
• 代理公司: 北京聿宏知識產權代理有限公司 11372
• 代理人: 吳大建;劉華聯

1.酶促合成寡肽的方法，所述方法包括將

i)包含4個或更多氨基酸殘基的寡肽酯，

-其包含至少兩個氨基酸殘基，每個氨基酸殘基帶有被保護基保護的側鏈官能團，并且包含活化的C末端酯，所述C末端酯由通式C(＝O)-O-CX₂-C(＝O)N-R₁R₂表示，其中，每個X各自獨立地表示氫原子或烷基或芳基，并且R₁表示氫原子或烷基或芳基，R₂表示氫原子或烷基或芳基或帶有C末端羧酰胺或羧酸官能團的氨基酸殘基或肽殘基，所述氨基酸殘基或肽殘基任選地在氨基酸殘基的側鏈官能團或在肽殘基的一個或多個側鏈官能團上被保護，

-并且其中，寡肽酯任選地包含N末端保護，

與

ii)包含4個或更多氨基酸殘基的寡肽親核劑，

-其包含N末端胺基，和至少兩個氨基酸殘基，每個氨基酸殘基帶有被保護基保護的側鏈官能團，并且

-其中，所述寡肽親核劑任選地包含C末端保護，

偶聯，所述偶聯在包含相對于偶聯反應主要發生于其中的液體總量的0.1體積％或以下的水的有機溶劑或有機溶劑混合物中，在枯草桿菌蛋白酶的存在下施行，并且其中除去在偶聯反應過程期間通過酶釋放的水。

2.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，寡肽酯通過使用連接物的固相合成來獲得。

3.根據權利要求2所述的方法，其特征在于，連接物是Sieber或Ramage連接物。

4.根據權利要求1-3中任意一項所述的方法，其特征在于，所有側鏈官能團中的至少50％被保護。

5.根據權利要求1-4中任意一項所述的方法，其特征在于，每個X表示氫原子。

6.根據權利要求1-5中任意一項所述的方法，其特征在于，R₁和R₂兩者都表示氫原子。

7.根據權利要求1-6中任意一項所述的方法，其特征在于，R₁表示氫原子，R₂表示帶有C末端羧酰胺或羧酸官能團的氨基酸殘基或肽殘基，任選地，其氨基酸殘基的側鏈官能團或者肽殘基的一個或多個側鏈官能團被保護。

8.根據權利要求1-7中任意一項所述的方法，其特征在于，除了寡肽酯的C末端氨基酸殘基的側鏈官能團之外，寡肽酯和寡肽親核劑的所有側鏈官能團被保護。

9.根據權利要求1-8中任意一項所述的方法，其特征在于，枯草桿菌蛋白酶是野生型枯草桿菌蛋白酶的變異體。

10.根據權利要求1-9中任意一項所述的方法，其特征在于，使用固定形式的枯草桿菌蛋白酶。

11.根據權利要求1-10中任意一項所述的方法，其特征在于，枯草桿菌蛋白酶以交聯酶聚集體的形式固定。

12.根據權利要求1-11中任意一項所述的方法，其特征在于，有機溶劑或有機溶劑混合物包含MTBE、THF、Me-THF、1,2-二甲氧基乙烷、二氯甲烷、1,2-二氯乙烷、TFE、DMF、NMP、DMA或DMSO。

13.根據權利要求12所述的方法，其特征在于，有機溶劑或有機溶劑混合物包含MTBE、MTBE與DMF或NMP或DMA或DMSO的混合物、二氯甲烷或者二氯甲烷與DMF或NMP或DMA或DMSO的混合物。

14.根據權利要求1-13中任意一項所述的方法，其特征在于，有機溶劑或有機溶劑混合物具有0.05體積％或以下的水含量。

15.根據權利要求1-14中任意一項所述的方法，其特征在于，連續除去通過酶釋放的水。

16.根據權利要求1-15中任意一項所述的方法，其特征在于，使用分子篩除去通過酶釋放的水。

17.根據權利要求1-16中任意一項所述的方法，其特征在于，偶聯反應在不存在鹽的條件下進行。