[發明專利]戊糖發酵微生物

有效

• 申請號: 201380018485.0
• 申請日: 2013-02-07
• 公開（公告）號: CN104204202B
• 公開（公告）日: 2017-08-01
• 發明（設計）人: Z·德拉戈維奇;C·加默夫;C·賴辛格;U·克特林
• 申請（專利權）人: 科萊恩產品（德國）有限公司
• 主分類號: C12N9/90
• 分類號: C12N9/90;C12P7/06;C12P19/24
• 代理公司: 北京尚誠知識產權代理有限公司11322
• 代理人: 龍淳

技術領域

木糖是植物生物質的主要基礎材料，并與現今生物精煉觀點聚焦的大量主要原料緊密相關。這類富含木糖的材料的實例包括麥秸、玉米秸稈或木片或其它木材副產品(Blake A Simmons等人.Genome Biol.2008；9(12):242)。

因此，通過酶促、化學或化學/酶促方法進行的起始材料的水解產生了其他有價值的糖之外的富含木糖的中間產物(Deepak Kumar等人.Biotechnol Biofuels.2011；4:27)。在耦合發酵路線中對富含C5的糖溶液的高效利用對于應用的發酵菌株既是至關重要的，也是必需的(Sara Fernandes and Patrick Murray,Bioeng Bugs.2010；1(6):424)。特別地，C6酵母(如釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae))由于較長歷史的培育(最終以極端耐乙醇和葡萄糖轉化高產量為特點)而成為理想的工作平臺，使得木糖完全不受影響，從而降低了潛在產量。已知的幾種策略可以避免這種缺陷。此處的關鍵步驟似乎為通過將木糖異構化為木酮糖以及隨后的C5非還原部分分流到釀酒酵母的常規糖酵解途徑的修飾級聯而成功地供料木糖。雖然對通過特定轉運蛋白的跨膜攝取木糖的強度和通過C5旁路可達到的通量密度進行了可能的改進(David Runquist等人Microb Cell Fact.2009；8:49)，但是木糖到木酮糖的關鍵異構化步驟在整個過程中成為主要問題。為進行該步驟已知有兩種主要途徑。第一，采用還原成木糖醇(通過木糖還原酶)和氧化(通過木糖醇脫氫酶)成木酮糖的后續步驟，導致NADH和NADPH輔因子之間的極大不平衡，并導致木糖醇在發酵條件下的形成增加(Maurizio Bettiga等人.Biotechnol Biofuels.2008；1:16)。應用木糖異構酶的備選的直接異構化途徑問題在于如下的木糖異構酶基因的可得性不足，其兼具有在真核微生物(特別是酵母，例如釀酒酵母)中的活性表達、高催化效率、與發酵溫度相適的溫度和最適pH以及副產物尤其是木糖醇的低抑制。本發明的一個方面是滿足此需求的蛋白質序列及編碼其的核酸的公開內容。

木糖異構酶途徑對于細菌物種和極少的酵母是原生的。相較于氧化還原酶途徑，異構酶途徑不需要輔因子。異構酶途徑最少由單一的酶——異源木糖異構酶(XI)組成，其直接將木糖轉化為木酮糖。就氧化還原酶途徑而言，通過共表達異源木酮糖激酶(XK)可以獲得產率的進一步提高。

首次功能性表達的XI是來源于厭氧真菌Piromyces物種E2(Kuyper M.等人FEMS Yeast Res.2003；4(1):69)的xylA基因。構建了在厭氧條件下能發酵作為唯一碳源的木糖的單倍體酵母菌株。大部分木糖異構酶是細菌蛋白并且主要障礙是其在酵母中的表達。然而近期的研究已經證實酵母中的功能性表達(表1)。由于木糖異構酶活性在C5發酵生物體理念中的關鍵重要性，希望使用最佳的木糖異構酶。就這方面而言，從先前的報道我們得知Clostridium phytofermentans木糖異構酶提供了較低但卻是可得的最高的技術標準。因此非常期待在本發明范圍內改進木糖異構酶的有益特性。

表1：所主張的應用于酵母中的木糖異構酶實例