[發(fā)明專利]重新折疊來自包涵體的G?CSF的方法

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201380015531.1
• 申請日: 2013-03-18
• 公開（公告）號: CN104540846B
• 公開（公告）日: 2017-05-24
• 發(fā)明（設(shè)計）人: F·費爾弗爾迪;A·鮑洛吉;J·貝奇
• 申請（專利權(quán)）人: 吉瑞工廠
• 主分類號: C07K14/435
• 分類號: C07K14/435
• 代理公司: 永新專利商標(biāo)代理有限公司72002
• 代理人: 左路

1.一種重新折疊來自包涵體的粒細(xì)胞集落刺激因子(G-CSF)的方法，其包括：

a)在增溶劑的存在下溶解G-CSF；

b)進行氧化和第一重新折疊步驟，包括在存在氧化劑和增溶劑的條件下溫育溶解的G-CSF；

c)通過離子交換樹脂吸附和/或離子交換色譜法除去增溶劑；和

d)進行第二重新折疊步驟，包括用低電導(dǎo)率緩沖液，或水，稀釋并溫育步驟(c)的G-CSF；

其中所述第二重新折疊步驟在電導(dǎo)率至少低于2mS/cm的低電導(dǎo)率緩沖液中進行多于12小時。

2.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中所述包涵體來自微生物。

3.根據(jù)權(quán)利要求2的方法，其中所述微生物是大腸桿菌。

4.根據(jù)權(quán)利要求1-3任一項的方法，其中所述G-CSF是重組牛或人甲硫氨酰-G-CSF。

5.根據(jù)權(quán)利要求1-3任一項的方法，其中所述增溶劑是N-月桂酰肌氨酸。

6.根據(jù)權(quán)利要求1-3任一項的方法，其中所述氧化劑為CuSO₄。

7.根據(jù)權(quán)利要求1-3任一項的方法，其中G-CSF的溶解在大于pH 7的pH值進行。

8.根據(jù)權(quán)利要求5的方法，其中所述增溶劑是濃度為0.5％至1.5％的N-月桂酰肌氨酸。

9.根據(jù)權(quán)利要求1-3任一項的方法，其中所述氧化和第一重新折疊步驟進行至少兩小時。

10.根據(jù)權(quán)利要求1-3任一項的方法，其中所述氧化和第一重新折疊步驟在通氣且不冷卻下進行。

11.根據(jù)權(quán)利要求1-3任一項的方法，其中所述氧化和第一重新折疊步驟是在7-9的pH值和/或在20-28℃的溫度進行，和/或進行15-25小時。

12.根據(jù)權(quán)利要求1-3任一項的方法，其中步驟(c)中的除去增溶劑包括陰離子交換層析和陽離子交換層析。

13.根據(jù)權(quán)利要求12的方法，其中步驟(c)中的除去增溶劑包括：

a)通過將G-CSF溶液與懸浮樹脂材料混合而結(jié)合陰離子交換樹脂材料，并通過過濾除去樹脂材料，和/或

b)在所述增溶劑與樹脂結(jié)合而G-CSF保留在流過物中的條件下進行離子交換層析，和/或

c)在G-CSF與樹脂結(jié)合而所述增溶劑保留在流過物中的條件下進行離子交換層析。

14.根據(jù)權(quán)利要求13的方法，其中通過順序應(yīng)用下列步驟除去所述增溶劑和其它雜質(zhì)：

(i)陰離子交換層析，

(ii)酸沉淀，

(iii)陰離子交換層析，和

(iv)陽離子交換層析。

15.根據(jù)權(quán)利要求14的方法，其中通過順序應(yīng)用下列步驟除去所述增溶劑和其它雜質(zhì)：

a)通過將G-CSF溶液與懸浮樹脂材料混合使增溶劑與陰離子交換樹脂材料結(jié)合，并通過過濾除去樹脂材料，

b)通過將pH降低到低于pH 5使雜質(zhì)沉淀，并通過過濾除去沉淀；

c)在剩余增溶劑與樹脂結(jié)合而G-CSF保留在流過物中的條件下進行陰離子交換層析；

d)在G-CSF與樹脂結(jié)合而剩余增溶劑保留在流過物中的條件下進行陽離子交換層析；和

e)通過使用pH或鹽濃度增加的洗脫緩沖液進行逐步或梯度洗脫，從陽離子交換樹脂洗脫結(jié)合的G-CSF。

16.根據(jù)權(quán)利要求1-3任一項的方法，其中所述第二重新折疊步驟在冷卻條件下進行。

17.根據(jù)權(quán)利要求1-3任一項的方法，其中所述第二重新折疊步驟在2-8℃的溫度進行，和/或進行至少24小時。

18.根據(jù)權(quán)利要求1-3任一項的方法，其中所述第二重新折疊步驟在高于pH 7的pH值進行。

19.根據(jù)權(quán)利要求1-3任一項的方法，其中該方法還包括精制步驟，其包括一個或多個離子交換層析。

20.根據(jù)權(quán)利要求19的方法，其中所述精制步驟中的一個或多個離子交換層析包括陰離子交換層析以及隨后的陽離子交換層析。

21.根據(jù)權(quán)利要求19的方法，其中所述一個或多個離子交換層析包括以下步驟：

a)在G-CSF與樹脂結(jié)合的條件下進行陰離子交換層析；

b)通過使用pH降低或鹽濃度增加的洗脫緩沖液的逐步或梯度洗脫，將結(jié)合的G-CSF洗脫；

c)在G-CSF與樹脂結(jié)合的條件下進行陽離子交換層析；

d)通過使用pH或鹽濃度增加的洗脫緩沖液的逐步或梯度洗脫將結(jié)合的G-CSF洗脫；

其特征在于，所述陰離子和陽離子交換樹脂的骨架聚合物均包含甲基丙烯酸酯衍生物。