[發明專利]核酸測序的改進方法

有效

• 申請號: 201380012596.0
• 申請日: 2013-03-06
• 公開（公告）號: CN104160040B
• 公開（公告）日: 2017-07-07
• 發明（設計）人: 尼爾·安東尼·葛姆雷;路易斯·弗雷澤;保拉·科克-岡薩雷斯
• 申請（專利權）人: 伊魯米納劍橋有限公司
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68
• 代理公司: 北京安信方達知識產權代理有限公司11262
• 代理人: 王思琪,鄭霞

本申請要求2012年3月6日提交的美國臨時專利申請序列號61/607,418的優先權，其通過引用全文并入本文。

背景

已經開發出對核酸包括RNA進行測序的測序技術。測序技術包括，例如，合成測序。合成測序或循環測序可以通過逐步加入含有例如可裂解或可光漂白的染料標記的核苷酸來實現，如在例如，美國專利號7,427,673；美國專利號7,414,116；WO 04/018497；WO 91/06678；WO 07/123744和美國專利號7,057,026中描述的，其公開內容通過引用全文并入本文。可選地，焦磷酸測序技術可以被采用。焦磷酸測序法檢測特定的核苷酸被摻入到新生鏈時無機焦磷酸(PPi)的釋放(Ronaghi等,(1996)“Real-time DNA sequencing using detection of pyrophosphate release.”Analytical Biochemistry242(1),84-9；Ronaghi,M.(2001)“Pyrosequencing sheds light on DNA sequencing.”Genome Res.11(1),3-11；Ronaghi,M.,Uhlen,M.and Nyren,P.(1998)“A sequencing method based on real-time pyrophosphate.”Science 281(5375),363；美國專利號6,210,891；美國專利號6,258,568和美國專利號6,274,320，其公開內容通過引用全文并入本文)。在焦磷酸測序中，釋放的PPi可以通過立即被ATP硫酸化酶轉化為三磷酸腺苷(ATP)來檢測，產生的ATP水平通過螢光素酶產生的光子被檢測到。

測序技術還包括連接測序技術。這種技術使用DNA連接酶摻入寡核苷酸并鑒定此類寡核苷酸的摻入，描述在美國專利號6,969,488；美國專利號6,172,218和美國專利號6,306,597中，其公開內容通過引用全文并入本文。其它測序技術包括，例如，熒光原位測序(FISSEQ)，和大規模平行信號測序(Massively Parallel Signature Sequencing,MPSS)。

制備測序用的DNA樣品可以是相對簡單的，包括使用轉座反應來片段化，并向DNA片段添加銜接子(adaptor)序列，這簡化樣品制備過程。見，例如，國際公布號WO 2010/048605，其通過引用全文并入本文。相比之下，目前用于對RNA樣品進行測序的方法采用在測序前將樣品中的RNA轉化成雙鏈cDNA形式的樣品制備方法。因此，制備測序用的RNA樣品是更加勞動密集型的。此外，當前的方法在保留鏈特異性信息方面絕非最佳。更具體地，大多數方法在轉化成雙鏈cDNA后不能夠保留有關原始單鏈RNA分子的方向的鏈信息。保存鏈特異性信息對于注釋新基因和確定基因表達水平非常重要。某些方法試圖通過在單鏈RNA分子的末端連接銜接子以保留鏈特異性信息。該銜接子可具有對從RNA分子產生的雙鏈cDNA的兩端提供可區分的信息的序列。然而，這種方法也有缺點。例如，如果所述RNA分子是片段，片段化后分子的內部部分失去其方向(即，鏈特異性)信息。

概述

本文提供將DNA:RNA雙鏈體加標簽的方法。該方法包括以下步驟：提供轉座酶和轉座子組合物，提供固定在支持物上的一種或更多種DNA:RNA雙鏈體，并且使轉座酶和轉座子組合物與一種或更多種DNA:RNA雙鏈體在其中一種或更多種DNA:RNA雙鏈體和轉座子組合物進行轉座反應的條件下接觸，以產生一種或更多種加標簽的DNA:RNA雙鏈體，其中所述轉座子組合物包含包含轉移鏈和非轉移鏈的雙鏈核酸分子。本方法還可用于將被固定在固體支持物上的DNA:DNA雙鏈體加標簽。

一個或更多個實施方案的細節闡述于附圖和以下描述中。其他特征、目的和優點，從說明書和附圖，以及從權利要求書，將是明顯的。

附圖說明