[發明專利]多焦結構化照明顯微系統和方法

有效

• 申請號: 201380010933.2
• 申請日: 2013-02-22
• 公開（公告）號: CN104471462B
• 公開（公告）日: 2017-09-19
• 發明（設計）人: H·什羅夫;A·約克
• 申請（專利權）人: 美國衛生與公共服務秘書部
• 主分類號: G02B21/00
• 分類號: G02B21/00
• 代理公司: 北京邦信陽專利商標代理有限公司11012
• 代理人: 賈博雍

相關申請的交叉引用

這是一件PCT專利申請，要求提交于2012年2月23日的美國臨時專利申請No.61/602,139的優先權，其整體通過引用并入此處。

技術領域

本申請涉及多焦結構化照明顯微，尤其涉及多焦結構化照明顯微系統以及用于產生由樣本的多焦圖案引起的多個多焦熒光發射的方法。

背景技術

經典的熒光顯微在分辨率方面受到光的波長的限制，這稱為“衍射極限”，當樣本發射由顯微鏡檢測的熒光時，在典型的激發和發射波長下的橫向分辨率限制為大約200nm，軸向分辨率限制為大約500nm。共焦顯微是一種光學成像技術，其用以通過使用點照明和空間針孔布置從厚于焦平面的標本消除離焦發射光，從而將光學分辨率提高超過衍射極限，因而通過要求緊密關閉針孔的方法以衍射極限1.41倍的分辨率來傳輸圖像。不幸地是，關閉針孔會將從樣本發射的光的信號水平降低到一定程度，導致該特定的超分辨率方法不實用。此外，共焦顯微鏡必須使來自顯微鏡的照明光束的激發與針孔/檢測器完美地對準，因為未對準的針孔會引起正在檢測的光信號降低和變弱，以及引起樣本本身的軸向光學斷層降低。這樣，共焦顯微鏡的未對準會引起光信號的降低。

已經發現了用于共焦顯微的分辨率增強的方法，該方法使用檢測器陣列(諸如照相機圖像中的像素)，其中陣列中的每個檢測器產生獨立的共焦圖像。如果檢測器陣列充分小，則每個形成的共焦圖像能夠等同于由具有緊閉針孔的共焦顯微鏡形成的類似的共焦圖像，使得當共焦圖像完全對準時實現了衍射極限顯微鏡的1.41倍的分辨率。此外，反卷積提供了圖像分辨率的進一步的提高。但是，該檢測器陣列布置會受到限制，因為在樣本的整個二維平面中僅掃描單個激發點，這會限制能夠掃描樣本的速度以及對樣本的熒光發射的后續檢測。

另一類型顯微稱為結構化照明顯微(SIM)，其以空間調制激發強度來照明樣本，空間調制激發強度相對于樣本平移和旋轉于不同位置，在每次平移和旋轉時獲取寬視野圖像。適當地處理原始圖像形成了最終圖像，最終圖像具有的橫向分辨率是常規寬視野顯微的橫向分辨率的兩倍。雖然這種SIM系統生成了具有常規顯微鏡的2倍空間分辨率的圖像，但是當產生最終圖像時卻犧牲了時間分辨率，因為需要時間來采集多個原始圖像中的每個。SIM還可以用來抑制離焦模糊，公知為“光學斷層”。但是，這種光學斷層是以計算方式來執行的，并且會受到散粒(泊松)噪聲。因而當背景熒光會引起該散粒噪聲貢獻超過焦點內信號時，SIM不適用于厚的或者高染色的樣本。

這樣，本領域中需要結構化照明顯微系統，其產生用于每個高分辨率圖像的樣本的多焦激發圖案，而不會犧牲掃描速度，并且對可能會干擾SIM圖像的散粒噪聲有抵抗力。

發明內容

在實施例中，顯微系統可以包括：光源，用于發送單個光束；以及分束器，用于將單個光束分成形成多焦圖案的多個光束。掃描器將形成多焦圖案的多個光束掃描到樣本上，使得樣本生成由每個多焦圖案引發的多個熒光發射。接著，聚焦部件限定了孔徑，所述孔徑構造為物理地阻擋由每個多焦圖案引發的多個熒光發射的離焦熒光發射，以及允許焦點內熒光發射通過所述孔徑。此外，縮放部件縮小由每個多焦圖案引發的多個焦點內熒光發射，使得所述多個焦點內熒光發射中的每個被縮小預定因子，以產生由每個多焦圖案引發的多個縮小的焦點內熒光發射。求和部件對所述多個縮小的焦點內熒光發射中的每個求和，以產生多個已求和的、縮小的焦點內熒光發射，所述多個已求和的、縮小的焦點內熒光發射形成所述多個已求和的、縮小的焦點內熒光發射的合成圖像。