[實用新型]一種全封閉一體式核酸擴增與檢測管

有效

• 申請號: 201320429171.7
• 申請日: 2013-07-19
• 公開（公告）號: CN203639460U
• 公開（公告）日: 2014-06-11
• 發明（設計）人: 周文彬;張師音;葛勝祥;陳杰裕;張軍;夏寧邵
• 申請（專利權）人: 廈門萬泰滄海生物技術有限公司;廈門大學
• 主分類號: C12M1/34
• 分類號: C12M1/34
• 代理公司: 中國國際貿易促進委員會專利商標事務所 11038
• 代理人: 林遠成

技術領域

本申請涉及分子生物學領域，特別是核酸擴增與檢測領域。具體而言，本申請涉及一種全封閉一體式核酸擴增與檢測管。此外，本申請還涉及一種擴增和檢測核酸的方法，其包括使用本申請的全封閉一體式核酸擴增與檢測管。此外，本申請還涉及包含所述全封閉一體式核酸擴增與檢測管的試劑盒，以及所述全封閉一體式核酸擴增與檢測管用于制備試劑盒的用途。?

背景技術

聚合酶鏈式反應技術（以下簡稱PCR技術），是一種在體外快速擴增DNA的技術，其通常包括多個循環，每個循環包括變性、退火和延伸三個步驟，并且在理想狀態下，每經過一個循環，目的核酸分子的數目就擴增一倍。一般而言，經過30-40個循環后，目的核酸分子數目就能擴增到原來的近10⁹倍。因此，PCR是體外大量獲得目的DNA片段的最有效方法，并且所獲得的核酸分子可用于進一步的分析和檢驗。?

目前，PCR技術已廣泛地應用于基礎研究和應用研究。例如，在基礎研究中，PCR作為一個“無細胞基因擴增系統”，可用于克隆基因，并由此可對基因組DNA進行直接序列分析，檢測突變位點，分析染色體重組等。在應用研究中，PCR則可以用于傳染病的診斷、遺傳疾病的檢測、產前診斷、法醫研究等。美國專利4,683,202；4,683,159；4,800,159；4,965,188等已對PCR技術做出了詳細描述。?

DNA的體內擴增是指，在細胞內有關因子的參與下，雙螺旋的DNA分子被解鏈成2條單鏈，在引物酶的作用下合成DNA引物，引物與單鏈DNA堿基互補配對，形成引物單鏈DNA復合物；在DNA聚合酶作用?下，沿著5’-3’方向，按堿基互補配對原則，在引物3’端開始，逐一將互補的三磷酸脫氧核苷酸接上，最終形成一條新的雙鏈DNA分子。?

DNA分子的體外PCR擴增模擬了體內的三個步驟：首先，在大約95℃的高溫下加熱雙鏈DNA分子，以使雙鏈間的氫鍵斷裂，從而使得DNA熱分解成兩條互補的單鏈DNA分子（這一過程稱為高溫解鏈反應）；然后，溫度迅速降到大約50-65℃的范圍內，在這個溫度下單鏈DNA與引物按堿基互補配對原則結合（這一過程稱為低溫退火反應）；退火反應結束后，溫度又迅速升高到72℃左右，在這個溫度下，在DNA聚合酶以及適當鎂離子濃度的條件下，從引物的3’端開始結合單核苷酸，從而形成一條新的DNA（這一過程稱為延伸反應）。經過一個這樣的過程，原來的一個DNA雙鏈分子就形成了兩個DNA分子，增加了一倍。反復進行高溫解鏈-低溫退火-中溫延伸三個過程，就可以獲得數量更多的復制雙鏈，并且這些新形成的雙鏈又可以作為下次循環的模板。?

通過這樣一種循環擴增方法，經過30-40個循環，目的核酸分子數目可由1個增加到原來的近10⁹倍。然而，PCR的高靈敏度始終伴隨著這樣的弊端，即，其極其容易被污染。僅僅1個DNA拷貝的污染就可能會導致獲得錯誤的檢測結果。因此，為了避免檢測過程中的樣品污染，國家衛生部明確規定：PCR臨床診斷必須將樣品處理、擴增和檢測在分割的房間進行，而且物流是從樣品處理，擴增至檢測一個方向進行，否則擴增后的試管不能進行開放檢測。?

因此，如何在PCR的全過程中避免污染也是現今核酸擴增和檢測領域的一個重要研究方向，并且也取得了很多的進展。例如，熒光PCR的出現使得對核酸產物的檢測避免了開管取樣的步驟，從而大大減少了核酸產物污染的機會。另外，UNG酶的使用也避免了PCR過程中核酸擴增產物的污染。然而，以上所述方法均需要昂貴的試劑或精密的儀器，且操作復雜，不適宜用于核酸的現場快速檢測。?

因此，本領域仍然迫切需要一種操作簡單、快速、成本低廉、能夠有效避免核酸擴增和檢測過程中的污染的方法和裝置。為此，本申?請開發出了一種全封閉一體式核酸擴增與檢測管。當使用本申請的全封閉一體式核酸擴增與檢測管進行核酸擴增和檢測時，在核酸擴增后無需開管即可進行核酸檢測，從而有效避免了擴增產物的外泄以及擴增和檢測中的污染。此外，使用本申請的全封閉一體式核酸擴增與檢測管進行核酸擴增和檢測時，操作簡單、成本低廉、無須使用昂貴的試劑或精密的儀器，從而，本申請的全封閉一體式核酸擴增與檢測管可廣泛應用于核酸的體外診斷，且特別適宜用于核酸的現場快速檢測。?

實用新型內容

在本申請中，除非另有說明，否則本文中使用的科學和技術名詞具有本領域技術人員所通常理解的含義。并且，本文中所用的分子遺傳學、核酸化學、免疫學實驗室操作步驟均為相應領域內廣泛使用的常規步驟。同時，為了更好地理解本申請，下面提供相關術語的定義和解釋。?