[發(fā)明專利]斜帶石斑魚性別調控基因Rspo1及其制備方法和應用

有效

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• 申請日: 2013-12-31
• 公開（公告）號: CN103724415A
• 公開（公告）日: 2014-04-16
• 發(fā)明（設計）人: 劉曉春;王升鵬;林浩然;張勇
• 申請（專利權）人: 中山大學
• 主分類號: C07K14/46
• 分類號: C07K14/46;C12N15/12;A61K38/17;A61P15/00
• 代理公司: 廣州嘉權專利商標事務所有限公司 44205
• 代理人: 鄭瑩

技術領域

本發(fā)明屬于水生動物基因工程技術領域，涉及一種斜帶石斑魚性別調控基因及其應用，特別涉及斜帶石斑魚性別調控基因Rspo1及其應用。

背景技術

Rspo1～4超家族，作為經(jīng)典Wnt信號的配體，它們之間有著40%～60%的蛋白一致性和結構同源性。Rspo蛋白包含一個N端信號肽，兩段臨近的富含半胱氨酸的區(qū)域，一段高同源的TSP-1模塊，以及一段包含雙向核定位信號的碳端尾巴。?他們在各種發(fā)育和癌癥發(fā)生通路中其重要作用。Rspo1的結構具有5`端信號肽，具有轉移分泌蛋白的作用；兩段含有半胱氨酸的弗林樣片段，這是它與其受體結合的重要部位；還有一段TSP-1（凝血酶敏感蛋白-1?）。在斜帶石斑魚的Rspo1中，未發(fā)現(xiàn)C端核定位信號。Rspo1是該超家族中的一種，它的最初發(fā)現(xiàn)是在人類性別調控方面發(fā)揮的重要作用。傳統(tǒng)觀點認為雌性性別決定和分化是被動的，但目前對RSPO1的研究卻對上述提出了質疑。

RSPO1?是一種小分泌因子，能夠刺激經(jīng)典的Wnt/b-連環(huán)素信號通路，提高細胞膜上的Wnt與Rspo1共受體LRP6的水平。重要的是，Wnt/b-連環(huán)素通路在卵巢和睪丸早期發(fā)育中起到重要作用。雌性小鼠敲除Rspo1很明顯發(fā)生性逆轉，有些生育能力降低。與Wnt4敲除不同，Rspo1敲除的小鼠部分是可育的，卵泡在一定程度上發(fā)育，但是大多數(shù)的雌性是不育的。敲除XX中RPSO1的小鼠發(fā)生明顯的性別轉化，局部上皮的Rspo1信號對于乳腺的發(fā)育是必須的。RSPO1是卵巢性別調控基因，它積極地掌管卵巢的分化，而WNT4是RSPO1的即時的或者是協(xié)同的下游基因，它和RSPO1重疊表達，直接或者間接地受RSPO1調節(jié)。我們推測，Rspo1在魚類中也可能存在相同性別調控的功能。

與高等的脊椎動物相比，大多數(shù)低等魚類沒有性染色體，其性別決定主要由多種性別調控基因所控制，至今依然沒有找到魚類的性別決定基因。魚類性別調控的研究，能夠使得人為控制魚類性別的分化和成熟，提早或者延遲魚類的性成熟，甚至可以人為調控魚類的性別轉化，得到轉化后的、具有功能性的雌魚或雄魚。此類研究的成果，將對人工養(yǎng)殖的工業(yè)化、現(xiàn)代化產(chǎn)生深遠影響。

石斑魚是一種深海性的名貴經(jīng)濟魚種，營養(yǎng)豐富，肉質細嫩潔白，類似雞肉，素有“海雞肉”之稱，成為港澳臺等地區(qū)的美味佳肴。在國際自然保護聯(lián)盟的“瀕危物種紅色名錄”上，163種石斑魚類，有20種面臨滅絕，另有5種屬瀕危水平。斜帶石斑魚屬鱸形目，屬于雌雄同體、雌性先熟的物種，群體生活，出生的時候都是雌性，成年后才會轉為雄性。斜帶石斑魚的這些特征使其成為研究性別調控的重要材料。因此，研究斜帶石斑魚及其性別調控機制，對于斜帶石斑魚功能基因組學及斜帶石斑魚育種、人工調控雌雄轉換、大規(guī)模工業(yè)化養(yǎng)殖的實現(xiàn)等等都具有重要的應用價值。

發(fā)明內容

本發(fā)明的目的在于提供一種斜帶石斑魚性別調控基因Rspo1及其應用。

本發(fā)明所采取的技術方案是：

斜帶石斑魚性別調控基因Rspo1的編碼蛋白，其氨基酸序列如SEQ?ID?NO:1所示。

編碼斜帶石斑魚性別調控基因Rspo1蛋白的核酸序列。

進一步的，上述核酸序列為基因Rspo1的cDNA，全長756bp，其序列如SEQ?ID?NO:2所示。

斜帶石斑魚性別調控基因Rspo1的重組蛋白含有如SEQ?ID?NO:3所示的氨基酸序列。

編碼斜帶石斑魚性別調控基因Rspo1的重組蛋白的核酸序列。

進一步的，上述核酸序列含有如SEQ?ID?NO:4所示的核酸序列。

Rspo1的編碼蛋白或重組蛋白在制備魚類性別催熟劑中的應用。

Rspo1的編碼蛋白或重組蛋白在制備魚類性別轉換劑中的應用。

本發(fā)明的有益效果是：

本發(fā)明方法利用反轉錄PCR?技術從斜帶石斑魚中克隆到了性別調控基因Rspo1，并構建了Rspo1的原核表達載體，可大量表達獲得斜帶石斑魚性別調控基因Rspo1所編碼的蛋白。

在本發(fā)明中，斜帶石斑魚Rspo1蛋白能夠在卵巢組織的大量表達，并說明了Rspo1參與調控斜帶石斑魚中其他性別調控基因的表達，豐富了魚類性別調控的系統(tǒng)信號通路理論，能為相關魚類性別調控的研究提供一定的理論依據(jù)。

在本發(fā)明中，斜帶石斑魚Rspo1蛋白在魚類催產(chǎn)、催熟、人工調控雌雄轉換、大規(guī)模工業(yè)化養(yǎng)殖等方面具有重要的應用價值。

附圖說明

圖1為基因Rspo1的PCR擴增圖；

圖2為重組質粒pQE30-Rspo1轉化大腸桿菌M15的菌液PCR驗證圖；