[發(fā)明專利]短小芽孢桿菌（Bacillus pumilus）LDS33及其應(yīng)用

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201310752611.7
• 申請(qǐng)日: 2013-12-31
• 公開（公告）號(hào): CN103849583A
• 公開（公告）日: 2014-06-11
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 劉冰花;羅亞雄;陶雪梅;蒲小龍;袁管明;梁煉國(guó)
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 成都大學(xué)
• 主分類號(hào): C12N1/20
• 分類號(hào): C12N1/20;C12P21/00;C12R1/07
• 代理公司: 成都科奧專利事務(wù)所(普通合伙) 51101
• 代理人: 王蔚

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，特別涉及一種短小芽孢桿菌（Bacillus?pumilus）LDS33及其在制備抗凝溶栓雙活性化合物中的應(yīng)用。?

背景技術(shù)

血栓栓塞性疾病是加速人體衰老、致殘、甚至死亡的直接原因和罪魁禍?zhǔn)祝砟睦镉醒埽睦锞陀锌赡馨l(fā)生血栓，因此，防治血栓已成為世界各國(guó)最關(guān)心的問題之一。?

溶栓抗凝療法是治療血栓性疾病效果最好的療法之一，抗血栓藥物的發(fā)展對(duì)控制血栓病人的死亡率和致殘率起到了十分重要的作用。目前，臨床上治療血栓病的藥物大都作用單一，要么只有溶栓作用，要么只有抗凝作用，使用時(shí)抗凝、溶栓需要分別給藥，這給臨床應(yīng)用帶來了許多不便之處，所以尋找溶栓活性高、副作用小、且具有溶栓和抗凝雙活性的藥物已逐漸成為全世界醫(yī)藥行業(yè)的研究熱點(diǎn)。?

短小芽孢桿菌（Bacillus?pumilus）屬于芽孢桿菌屬，產(chǎn)生活性物質(zhì)的概率很高，不僅可以產(chǎn)生多種酶，如耐熱木聚糖酶、耐熱絲氨酸堿性蛋白酶、谷氨酰內(nèi)肽酶、膽紅素氧化酶、膠原蛋白酶、脂肪酶、耐熱角蛋白酶、降解毒死蜱的酶、降解石油的酶、降解血紅蛋白的酶等，還可以產(chǎn)生多種抗生素，特別是抗真菌的抗生素。所以尋找新的抗血栓藥物，同時(shí)發(fā)掘短小芽孢桿菌的新用途，具有重要的科學(xué)研究和應(yīng)用價(jià)值。?

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的在于提供一種可產(chǎn)生抗凝溶栓雙活性作用化合物的短小?芽孢桿菌（Bacillus?pumilus）LDS33。?

本發(fā)明的另一目的在于提供上述短小芽孢桿菌LDS33在制備具有抗凝溶栓雙活性作用化合物中的應(yīng)用。?

本發(fā)明提供的短小芽孢桿菌（Bacillus?pumilus）LDS33已于2013年05月07日保藏于中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏地址為湖北省武漢市武昌珞珈山武漢大學(xué)保藏中心，保藏號(hào)為：CCTCC?NO：M2013179，GenBank登錄號(hào)為：KF515275。?

本發(fā)明提供的短小芽孢桿菌（Bacillus?pumilus）LDS33在VY/4平板上的菌落為淡黃色、較薄、表面黏濕，邊緣不整齊，有很多樹葉邊緣狀的突起。該菌株在VY/4平板上生長(zhǎng)緩慢，可滑動(dòng)。其菌體長(zhǎng)約1.67μm-3.67μm，寬約0.5μm-0.67μm。?

菌株Bacillus?pumilus?LDS33既可在VY/4培養(yǎng)基上生長(zhǎng)，又可在LB培養(yǎng)基上生長(zhǎng)，適宜的生長(zhǎng)溫度為15℃-50℃，最佳生長(zhǎng)溫度為30℃-35℃。另外，菌株Bacillus?pumilus?LDS33培養(yǎng)是在好氧條件下進(jìn)行的，培養(yǎng)基的pH范圍為pH4.0-pH12.0，說明該菌既可在酸性條件下生長(zhǎng)繁殖，又可在堿性條件下生長(zhǎng)繁殖，pH8.5-pH9.0是其最適的生長(zhǎng)條件。?

本發(fā)明提供的短小芽孢桿菌（Bacillus?pumilus）LDS33可用于提取具有抗凝和溶栓雙活性作用的化合物。?

本發(fā)明的短小芽孢桿菌（Bacillus?pumilus）LDS33菌株具有耐堿、耐鹽、耐熱、耐冷，易于培養(yǎng)、培養(yǎng)成本低、不受體系中有機(jī)物抑制等優(yōu)點(diǎn)，其發(fā)酵液可用于提取具有抗凝溶栓雙活性作用的化合物，該化合物活性高、穩(wěn)定性好，可用于抗血栓藥物或保健品領(lǐng)域。?

附圖說明

圖1為抗凝溶栓雙活性化合物在纖維蛋白平板上形成的透明圈。?

圖2為尿激酶標(biāo)準(zhǔn)曲線。?

圖3為菌株LDS33的基因同源性的系統(tǒng)發(fā)育樹。?

圖4為菌株LDS33在不同pH值的LB培養(yǎng)基中的生長(zhǎng)狀況。?

圖5為Sephadex?G-200層析圖譜。?

圖1中：①30μL10U/mL尿激酶；②30μL100U/mL尿激酶；③30μL500U/mL尿激酶；④30μL1000U/mL尿激酶；⑤30μL2500U/mL尿激酶；⑥30μL5000U/mL尿激酶；⊙30μL菌株LDS33的胞外濃縮液。?

圖3中：圓括號(hào)內(nèi)為GenBank中的登錄號(hào)。每個(gè)分支點(diǎn)處的數(shù)字為Bootstrap（1000次重復(fù)抽樣）的支持百分率。標(biāo)尺代表1%的序列差異。?

圖5中：峰A為活性峰，其它峰為雜蛋白峰。?

具體實(shí)施方式

實(shí)施例1?

1.短小芽孢桿菌（Bacillus?pumilus）LDS33的篩選?

（1）材料?

a.樣品：?

采自成都市及周邊洛帶、龍泉驛、雙流等地的兔糞、羊糞、泥土、水等共20個(gè)樣品。樣品采回后風(fēng)干，馬上使用(水樣不用風(fēng)干，采回后直接使用)。?