[發明專利]化學合成的金黃色葡萄球菌的表面蛋白FnBPA基因片段及其表達、應用

有效

• 申請號: 201310750813.8
• 申請日: 2013-12-31
• 公開（公告）號: CN103725697A
• 公開（公告）日: 2014-04-16
• 發明（設計）人: 李越希;李丙軍;許桂麗;馬穎;張素芬;袁敬宇;徐悅玥;潘英;李素芹;陳樂如;蔡冉;周潔;尚彥紅
• 申請（專利權）人: 李越希
• 主分類號: C12N15/31
• 分類號: C12N15/31;C12N15/70;C07K14/31;C07K16/12;G01N33/569
• 代理公司: 南京君陶專利商標代理有限公司 32215
• 代理人: 奚勝元

技術領域

本發明涉及的是化學合成的金黃色葡萄球菌的表面蛋白FnBPA基因片段及其表達、應用，利用基因工程技術，制備重組金黃色葡萄球菌的表面蛋白FnBPA。通過計算機分析，篩選出含強抗原表位的FnBPA片段，選擇原核生物偏愛的密碼子，化學合成全新的基因序列，利用基因工程技術表達，表達的蛋白可用于疫苗及金黃色葡萄球菌快速檢測方法的建立等，本發明涉及基因工程技術和診斷試劑領域。

背景技術

金黃色葡萄球菌是一種能引起人類和動物疾病的條件致病菌。它作為正常菌群寄生于人類皮膚和粘膜表面，占醫院感染和社區獲得性感染的大部分。金葡菌能引起皮膚和軟組織感染，以及危及生命的轉移性并發癥，如肺炎、菌血癥，心內膜炎，化膿性關節炎和骨髓炎，它廣泛存留于醫院，引起免疫系統損傷的宿主和手術病人感染，并存留醫療器械中。金黃色葡萄球菌在自然界中無處不在，空氣、水、灰塵及人和動物的排泄物中都可找到，因此，奶、肉、蛋、魚及其制品等食品受其污染的機會很多。金黃色葡萄球菌也是各級衛生機構重點檢測的病原體之一。因此，建立金黃色葡萄球菌的快速檢測方法非常重要。?

?????傳統鑒定和分離金黃色葡萄球菌的方法步驟較多，并且具有一定的局限性。首先要根據被檢測的致病菌類型對樣品進行富集培養，其鑒定結果一般只能定性不能定量，并且所需時間長，速度慢，一般3~4d才能推測結果，準確鑒定需要5~7天。大多數免疫學技術例如熒光標記抗體實驗、酶聯免疫試驗（ELISA）、放射性免疫試驗等都得到廣泛應用，但它們所需成本較高、耗時且對樣品進行復雜的處理，限制其在生活中的廣泛應用。建立一種簡單、快速、適合現場應用的金黃色葡萄球菌的檢測方法有重要的意義。

發明內容

本發明是化學合成的金黃色葡萄球菌表面蛋白FnBPA的全新基因片段，利用基因工程技術，制備重組金黃色葡萄球菌的FnBPA的部分片段。通過計算機分析，篩選出含強抗原表位的金黃色葡萄球菌表面蛋白FnBPA的部分片段?,第745個氨基酸－第877個?氨基酸，共133個氨基酸，選擇原核生物偏愛的密碼子，化學合成全新的基因序列，利用基因工程技術在大腸桿菌BL21中表達該基因。表達的蛋白可用于單克隆抗體和多克隆抗體的制備，為金黃色葡萄球菌檢測方法的建立奠定了基礎。

金黃色葡萄球菌產生的細胞外結合基質蛋白（ECMBP），包括FnBP、ClfA?和Ebp等，它們均為細菌表面的蛋白成分，具有相似的結構。FnbpA是纖連蛋白結合蛋白（?Fnbp）的一種，是細菌表面的蛋白質成分。通過對金黃色葡萄球菌臨床分離株Fnbp的雙重PCR檢測，發現95%以上的菌株存在粘附素基因FnbpA而FnbpB基因僅有10%，本研究選用FnBPA作為研究對象。

通過計算機軟件分析，篩選出金黃色葡萄球菌的特異性表面蛋白FnPFA抗原表位富集區，選擇原核生物偏愛的密碼子優化基因序列，化學合成全新的基因序列，利用基因工程技術表達。表達的蛋白具有較好的抗原性和特異性，可用于單克隆抗體和多克隆抗體的制備，為金黃色葡萄球菌快速檢測方法的建立奠定基礎。

化學合成的金黃色葡萄球菌表面蛋白FnBPA的133個氨基酸的基因片段及其表達、應用是采取以下步驟實現的：

1．金黃色葡萄球菌表面蛋白FnBPA抗原表位的篩選及其基因片段的化學合成：

利用ANTHEWIN、DNAStar等軟件，通過計算機分析金葡菌表面蛋白FnBPA的全氨基酸序列，?發金葡菌表面蛋白FnBPA的N端（第745氨基酸?—?第877?氨基酸）含有較強的抗原決定簇。選擇原核生物偏愛的密碼子，化學合成全新的基因序列，并且在5'端增加了BamH?I酶切位點（下畫線部分），在3'端增加了終止密碼子（TGA）和Xho?I酶切位點（下畫線部分），使該基因片段易于克隆至質粒pGEX4T-2的BamH?I和Xho?I酶切位點內。

篩選的金黃色葡萄球菌表面蛋白FnBPA內的抗原表位氨基酸序列（第745個aa－第877個aa）：