[發(fā)明專利]化學合成的金黃色葡萄球菌的表面蛋白FnBPA基因片段及其表達、應用

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201310750813.8
• 申請日: 2013-12-31
• 公開（公告）號: CN103725697A
• 公開（公告）日: 2014-04-16
• 發(fā)明（設計）人: 李越希;李丙軍;許桂麗;馬穎;張素芬;袁敬宇;徐悅玥;潘英;李素芹;陳樂如;蔡冉;周潔;尚彥紅
• 申請（專利權）人: 李越希
• 主分類號: C12N15/31
• 分類號: C12N15/31;C12N15/70;C07K14/31;C07K16/12;G01N33/569
• 代理公司: 南京君陶專利商標代理有限公司 32215
• 代理人: 奚勝元

1.一種化學合成的金黃色葡萄球菌表面蛋白FnBPA的基因片段，該基因片段編碼含強抗原表位的金黃色葡萄球菌表面蛋白FnBPA基因片段，即第745個氨基酸至第877個氨基酸，共133個氨基酸，在該基因片段的5'端增加了BamH?I酶切位點（下劃線部分），在3'端增加了終止密碼子TGA和Xho?I酶切位點（下劃線部分），化學合成的基因序列全長414bp，序列如下：

GGATCC??GGT?CAG?AAC?AGC?GGT?AAC?CAG?TCG?TTT?GAA?GAA?GAC?ACG?GAA?GAA?GAT?AAG?CCG?AAG?TAT?GAA?CAG?GGT?GGC?AAC?ATT?GTG?GAC?ATT?GAT?TTT?GAC?AGT?GTC?CCG?CAG?ATT?CAT?GGC?CAA?AAC?AAA?GGT?AAT?CAG?TCC?TTC?GAA?GAA?GAC?ACC?GAA?AAA?GAT?AAG?CCG?AAA?TAT?GAA?CAC?GGC?GGT?AAC?ATT?ATC?GAT?ATT?GAC?TTT?GAT?AGC?GTT?CCG?CAT?ATC?CAC?GGC?TTC?AAC?AAG?CAT?ACC?GAA?ATT?ATC?GAA?GAA?GAC?ACG?AAT?AAG?GAT?AAA?CCG?AGC?TAC?CAA?TTT?GGC?GGT?CAC?AAT?TCT?GTG?GAC?TTC?GAA?GAA?GAT?ACG?CTG?CCG?AAA?GTT?TCC?GGT?CAG?AAC?GAA?GGC?CAG?CAG?ACG?ATT?GAA?GAA?GAC?ACG?ACG?CCG?CCG?ATT?GTT?TGA?CTCGAG。

2.權利要求1所述的化學合成的金黃色葡萄球菌表面蛋白FnBPA的基因片段，采用基因工程技術表達該基因序列編碼的金黃色葡萄球菌表面蛋白FnBPA基因片段，純化表達的蛋白片段，具體方法如下：

金黃色葡萄球菌表面蛋白FnBPA基因片段重組質(zhì)粒的構建:

用?BamH?I和Xho?I雙酶切質(zhì)粒pGEX4T-2和化學合成的金黃色葡萄球菌表面蛋白FnBPA基因片段，電泳回收后，用T4?DNA?連接酶連接，使金黃色葡萄球菌表面蛋白FnBPA基因片段插入到載體pGEX4T-2內(nèi)的BamH?I和Xho?I位點之間，與載體上的起始密碼子翻譯框架一致，表達一個融合蛋白，全長359個氨基酸,該融合蛋白N端融合了載體上的226個氨基酸，C端包含金黃色葡萄球菌表面蛋白FnBPA內(nèi)的第745個氨基酸至第877個氨基酸，全長氨基酸序列如下：

Met?Ser?Pro?Ile?Leu?Gly?Tyr?Trp?Lys?Ile?Lys?Gly?Leu?Val?Gln?Pro?Thr?Arg?Leu?Leu?Leu?Glu?Tyr?Leu?Glu?Glu?Lys?Tyr?Glu?Glu?His?Leu?Tyr?Glu?Arg?Asp?Glu?Gly?Asp?Lys?Trp?Arg?Asn?Lys?Lys?Phe?Glu?Leu?Gly?Leu?Glu?Phe?Pro?Asn?Leu?Pro?Tyr?Tyr?Ile?Asp?Gly?Asp?Val?Lys?Leu?Thr?Gln?Ser?Met?Ala?Ile?Ile?Arg?Tyr?Ile?Ala?Asp?Lys?His?Asn?Met?Leu?Gly?Gly?Cys?Pro?Lys?Glu?Arg?Ala?Glu?Ile?Ser?Met?Leu?Glu?Gly?Ala?Val?Leu?Asp?Ile?Arg?Tyr?Gly?Val?Ser?Arg?Ile?Ala?Tyr?Ser?Lys?Asp?Phe?Glu?Thr?Leu?Lys?Val?Asp?Phe?Leu?Ser?Lys?Leu?Pro?Glu?Met?Leu?Lys?Met?Phe?Glu?Asp?Arg?Leu?Cys?His?Lys?Thr?Tyr?Leu?Asn?Gly?Asp?His?Val?Thr?His?Pro?Asp?Phe?Met?Leu?Tyr?Asp?Ala?Leu?Asp?Val?Val?Leu?Tyr?Met?Asp?Pro?Met?Cys?Leu?Asp?Ala?Phe?Pro?Lys?Leu?Val?Cys?Phe?Lys

Lys?Arg?Ile?Glu?Ala?Ile?Pro?Gln?Ile?Asp?Lys?Tyr?Leu?Lys?Ser?Ser?Lys?Tyr?Ile?Ala?Trp?Pro?Leu?Gln?Gly?Trp?Gln?Ala?Thr?Phe?Gly?Gly?Gly?Asp?His?Pro?Pro?Lys?Ser?Asp?Leu?Val?Pro?Arg?Gly?Ser?Gly?Gln?Asn?Ser?Gly?Asn?Gln?Ser?Phe?Glu?Glu?Phe?Thr?Glu?Glu?Asp?Lys?Pro?Lys?Tyr?Glu?Gln?Gly?Gly?Asn?Ile?Val?Asp?Ile?Asp?Phe?Asp?Ser?Val?Pro?Gln?Ile?His?Gly?Gln?Asn?Lys?Gly?Asn?Gln?Ser?Phe?Glu?Glu?Asp?Thr?Glu?Lys?Asp?Lys?Pro?Lys?Tyr?Glu?His?Gly?Gly?Asn?Ile?Ile?Asp?Ile?Asp?Phe?Asp?Ser?Val?Pro?His?Ile?His?Gly?Phe?Asn?Lys?His?Thr?Glu?Ile?Ile?Glu?Glu?Asp?Thr?Asn?Lys?Asp?Lys?Pro?Ser?Tyr?Gln?Phe?Gly?Gly?His?Asn?Ser?Val?Asp?Phe?Glu?Glu?Asp?Thr?Leu?Pro?Lys?Val?Ser?Gly?Gln?Asn?Glu?Gly?Gln?Gln?Thr?Ile?Glu?Glu?Asp?Thr?Thr?Pro?Pro?Ile?Val

表達融合蛋白工程菌的篩選鑒定:

將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21，涂布含100μg／ml氨芐青霉素的LB平板，置37℃?過夜，次日隨機挑取轉(zhuǎn)化菌落和含質(zhì)粒pGEX4T-2的對照菌，提取質(zhì)粒?，雙酶切驗證,切出414bp的目的條帶；將含有外源基因的質(zhì)粒進行DNA序列分析，序列分析證實重組質(zhì)粒含有金黃色葡萄球菌fnbpa基因片段，序列完全正確；將含有重組質(zhì)粒的陽性轉(zhuǎn)化子，接種至含氨芐青霉素100μg／mL?的LB培養(yǎng)基內(nèi)，37℃振蕩培養(yǎng)4h，加IPTG至終濃度0.2?mmol/L,繼續(xù)振蕩培養(yǎng)誘導4h，離心收集菌體進行SDS-PAGE檢測,重組子表達相對分子量約為42?kD的金葡菌表面蛋白FnBPA，表達量約為20%，而含空質(zhì)粒pGEX4T-2的對照菌無此蛋白帶；

表達金黃色葡萄球菌表面蛋白FnBPA的純化：

將誘導表達融合蛋白的工程菌離心，收菌，菌體重懸于裂解液（20mmol/L?PB?pH8.0、10?mmol/L?EDTA、1mmol/L?DTT、5%甘油），冰浴超聲破菌75次，離心收集上清，上清溶液加已經(jīng)平衡的High-Affinity?GSH?Resin凝膠10ml，4℃結合過夜,上樣，收集穿透液；用十倍柱床體積的1×PBS洗滌柱子，接著用50ml高濃度的GSH洗脫液（50?mmol/L?Tris-HCl?pH8.0?+?10?mmol/L?GSH）分三次洗脫目的蛋白,即為純化的金葡菌FnBPA蛋白片段。