[發明專利]一種含有NADH激酶基因的工程菌及其用途

有效

• 申請號: 201310750790.0
• 申請日: 2013-12-31
• 公開（公告）號: CN103740630A
• 公開（公告）日: 2014-04-23
• 發明（設計）人: 李正軍;陳國強;吳瓊;張潔
• 申請（專利權）人: 北京化工大學
• 主分類號: C12N1/21
• 分類號: C12N1/21;C12N15/70;C12P7/62;C12R1/19
• 代理公司: 北京紀凱知識產權代理有限公司 11245
• 代理人: 關暢

技術領域

本發明涉及生物技術領域，尤其涉及一種含有NADH激酶基因的工程菌及其用途。

背景技術

NAD(H)和NADP(H)是生物體內的重要輔酶，它們主要作為電子載體參與各種氧化還原反應。輔酶涉及的反應非常廣泛，其濃度的改變會引起細胞內物質和能量代謝的變化，從而影響許多代謝產物的合成。通過對細胞內的輔酶濃度和氧化還原態比率等進行調控以期提高生物合成的效率受到越來越多的關注。NADH激酶能夠利用ATP等作為磷酸基團的供體，催化NADH的磷酸化形成NADPH，在生物體內的輔酶代謝中起到了非常關鍵的作用。釀酒酵母Saccharomyces?cerevisiae中的NADH激酶基因有三個，分別為UTR1、YEF1和POS5（Genomic?characterization?of?POS5,the?Saccharomyces?cerevisiae?mitochondrial?NADH?kinase,Mitochondrion,2006,6(2):94-101），其中位于線粒體內的Pos5所催化的反應被認為是線粒體內還原型輔酶NADPH的主要來源，在抗氧化等多個生理功能中起到重要的作用（Mitochondrial?NADH?kinase,Pos5p,is?required?for?efficient?iron-sulfur?cluster?biogenesis?in?Saccharomyces?cerevisiae,Journal?of?Biological?Chemistry,2010,285(50):39409-39424）。

目前被研究確定的NADH激酶還有Podospora?anserina中的Ndk1（Deletion?of?the?mitochondrial?NADH?kinase?increases?mitochondrial?DNA?stability?and?life?span?in?the?filamentous?fungus?Podospora?anserine,Experimental?Gerontology,2010,45(7-8):543-549）和Entamoeba?histolytica中的Nadhk（Biochemical?and?functional?characterization?of?novel?NADH?kinase?in?the?enteric?protozoan?parasite?Entamoeba?histolytica,Biochimie,2013,95(2):309-319）等。

聚-3-羥基丁酸酯（poly-3-hydroxybutyrates，簡稱PHB）是許多微生物在特定的生長條件下在細胞內積累的一種高分子聚合物，主要用來作為碳源和能量的貯藏物質，在營養匱乏時重新分解利用，賦予細胞多樣的生理潛能。PHB具有與類似塑料（聚乙烯、聚丙烯等）的材料學性質，與石油來源的塑料材料不同的是，PHB可以由可再生物質資源（淀粉、纖維素、脂肪酸等）通過微生物轉化的方法獲得，廢棄在自然環境中以后，PHB可以由微生物較快的完全降解為二氧化碳和水，具有生物可再生、生物可降解等特性，可以作為傳統的不可降解的石油來源塑料材料的補充，因而受到了廣泛關注（Increased?diversification?of?polyhydroxyalkanoates?by?modification?reactions?for?industrial?and?medical?applications，Applied?Microbiology?and?Biotechnology,2007,74(1):1-12）。在大多數微生物中，PHB是由糖類等物質降解產生的乙酰輔酶A為前體來合成的，在phaA基因編碼的β-酮基硫解酶的作用下，兩個乙酰輔酶A分子縮合生成乙酰乙酰輔酶A，接下來phaB基因編碼的NADPH依賴的乙酰乙酰輔酶A還原酶催化乙酰乙酰輔酶A還原為(R)-3-羥基丁酰輔酶A（3HB-CoA），最后由PHA聚合酶催化聚合成PHB。還原型輔酶NADPH參與了PHB的合成反應，胞內可利用的還原力水平是被認為是影響PHB合成的重要因素。目前制約PHB大規模工業化生產的關鍵問題是其相對石油來源塑料材料高的多的生產成本。對微生物中PHB的生物合成過程進行全面系統的研究，對生產菌種進行有針對性的基因改造，提高PHB合成的效率，將有助于降低生產成本，推進PHB的產業化進程。

發明內容

本發明的一個目的是提供一種構建重組菌的方法。