[發明專利]大豆疫霉菌對甲霜靈抗性的AFLP指紋圖譜構建

在審

• 申請號: 201310738820.6
• 申請日: 2013-12-30
• 公開（公告）號: CN104745677A
• 公開（公告）日: 2015-07-01
• 發明（設計）人: 劉淑霞;潘冬梅;杜春玉;魏國江;沈玉江;國莉玲;高宇;韓喜財;宋鑫玲
• 申請（專利權）人: 黑龍江省科學院大慶分院
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;C12Q1/04;C12R1/645
• 代理公司: 無
• 代理人: 無

1.大豆疫霉菌對甲霜靈抗性的AFLP指紋圖譜構建方法，其特征在于采用大豆疫霉菌對甲霜靈的抗藥性穩定突變體，進行AFLP指紋圖譜構建并獲得特異性條帶；

所述抗藥性穩定突變體的篩選采用：甲霜靈馴化誘導，甲霜靈直接誘變和EMS化學誘變，將獲得的抗甲霜靈突變體進行穩定性分析并測定其對甲霜靈的抗性水平；

所述AFLP指紋圖譜的構建包括下述步驟：利用優化體系引物組合構建誘導錢的野生菌株和誘導后的抗性菌株不同引物組合的DNA指紋圖譜，獲得特異性條帶。

2.如權利要求1所述的大豆疫霉菌對甲霜靈抗性的AFLP指紋圖譜構建方法，其特征在于：所述抗藥性穩定突變體的篩選方式為：

所述甲霜靈馴化誘導：將供試菌株置于胡蘿卜瓊脂培養基(CA)上，25℃、黑暗培養6-8d，然后移入含有0.1μg／mL甲霜靈的CA平板上，8d后將在含甲霜靈平板上生長相對較快的菌絲塊轉移至含有相同含量的甲霜靈平板上，以后每隔8d轉1次，并逐漸增大甲霜靈的含量，直至能在含10μg／mL甲霜靈的CA平板上生長，從而獲得馴化抗性突變菌株；

所述甲霜靈抗性突變株的直接誘導：將供試菌株置于CA平板上，25℃、黑暗培養6-8d，然后移入含有甲霜靈0.1μg／mL的CA上，每培養皿接種4塊，每菌株接種10個培養皿，接種后的培養皿用封口膜封口，置25℃黑暗培養，3d后每隔1d觀察菌絲塊生長情況。將各菌株菌絲塊邊緣產生的快速生長角變區分別移至含甲霜靈0.1μg／mL的CA上，能較好生長的菌株即可能為突變菌株，直至找到能在含10μg／mL甲霜靈的CA平板上生長的抗性菌株為止；

所述甲霜靈抗性突變株的化學誘導采用甲基磺酸乙酯(EMS)化學誘變劑處理大豆疫霉菌游動孢子懸浮液，然后涂布在含甲霜靈的CA培養基上，篩選抗性突變體。

3.如權利要求1所述大豆疫霉菌對甲霜靈抗性的AFLP指紋圖譜構建方法，其特征在于所述AFLP指紋圖譜的構建按如下步驟進行：

1.提取抗性突變菌株DNA，制備高純度DNA樣品備用；

1)酶切連接：反應體系50μL：DNA50ng，EcoR?I12U，Mse?I10U，BSA1.2μg，NEB?Buffer；加入10μL連接混合液：EcoR?I接頭5pmol和Mse?I接頭50pmol，ATP10pmol，T₄DNA連接酶3U，充分混勻離心，分別37℃水浴6h；

2)預擴和選擴：取5μL連接后的DNA樣品，加入15μL預擴增混合液：EcoR?I預擴引物和Mse?I預擴引物各75ng，1×PCR?Buffer，Taq酶0.5U，dNTP4mmol，混勻后，94℃30s，56℃30s，72℃60s，循環30個；取5μL預擴增稀釋產物，加入15μL選擇性擴增混合液：dNTP4nmol，引物混合液0.5μL，Taq酶0.5U，1×PCR?Buffer，混勻后，94℃30s，65℃30s，72℃60s，12個循環后變為：94℃30s，56℃30s，72℃60s，23個循環；加入20μL?Loading?Buffer，混勻后，95℃變性5min，冰浴冷卻，聚丙烯酰胺膠電泳、數據分析；其中所述的連接混合液指的是：EcoR?I和Mse?I接頭各25pmol，ATP1nmol，T4DNA連接酶2U，1×Reaction?Buffer；

所述預擴增混合液我：EcoR?I預擴引物和Mse?I預擴引物各75ng，1×PCR?Buffer，Taq酶0.5U，dNTP4mmol，混勻；

所述選擇性擴增混合液指的是：dNTP4nmol，引物混合液0.5μL，Taq酶0.5U，1×PCR?Buffer；

所述預擴增稀釋產物指的是：取5μL步驟(1)連接后的DNA樣品，EcoR?I預擴引物和Mse?I預擴引物各75ng，1×PCR?Buffer，Taq酶0.5U，dNTP4mmol，混勻后，94℃30s，56℃30s，72℃60s，循環30個，反應所得；

所述EcoR?I預擴引物和Mse?I預擴引物序列為：

EcoR?I預擴引物序列：5′-CTCGTAGACTGCGTACCC-3′NO1

EcoR?I預擴引物序列：5′-CATCTGACGCATGGTTAA-3′NO2

Mse?I預擴引物序列：5′-GACGATGAGTCCTGAG-3′NO3

Mse?I預擴引物序列：5′-TACTCAGGACTCAT-3′NO4

引物混合液指的是EcoR?I引物1μl，Mse?I引物1μl；

ISSR反應體系20μl：10×Buffer2μl，20mM的dNTPs2μl，2U／μl的Taq酶1μl，模板DNA1μl，20mM的Mg²⁺3μl，4pmol／μl的引物1.25μl；94℃預變性5min；94℃1min，52℃1min，72℃1.5min40次循環，72℃5min，4℃保存，取8μl擴增產物于2.5％的瓊脂糖凝膠上電泳、數據分析；

所述引物指的是下面任意一種：

其中的Y代表C或T；

2.SSR共顯性標記：

反應體系25μl：ddH₂O12.5μl，10×Buffer2.5μl，2mM的dNTPs2.5μl，25mM的Mg²⁺1.75μl，2U／μl的Taq酶0.75μl，20ng的模版DNA1μl，上游引物2μl，8pmol／μl的下游引物2μl；94.0℃5min；94.0℃1min，58.0℃1min，72.0℃1min，35個循環，72.0℃5min，4℃保存，取8μl擴增產物于2.5％的瓊脂糖凝膠上電泳、數據分析；

所述上游引物指的是NO13～20任意一個；下游引物指的是NO21～28任意一個，且上游引物與下游引物一一對應：