[發(fā)明專利]一種人體表皮組織的快速構(gòu)建制備方法

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201310737713.1
• 申請(qǐng)日: 2013-12-27
• 公開（公告）號(hào): CN103721294A
• 公開（公告）日: 2014-04-16
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 安美文;劉陽(yáng);王立;陳凌峰
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 太原理工大學(xué)
• 主分類號(hào): A61L27/60
• 分類號(hào): A61L27/60;A61L27/26
• 代理公司: 太原市科瑞達(dá)專利代理有限公司 14101
• 代理人: 江淑蘭

1.一種人體表皮組織的快速構(gòu)建制備方法，其特征在于：使用的化學(xué)物質(zhì)材料為：人體皮膚組織、殼聚糖、明膠、人體表皮角質(zhì)形成細(xì)胞培養(yǎng)液、高糖培養(yǎng)基、氯化鈣、碘酒、磷酸鹽溶液、硫酸慶大霉素、青霉素、蛋白酶、膠原酶、胎牛血清、胰蛋白酶、乙二胺四乙酸、醋酸、戊二醛、氫氧化鈉、硼氫化鈉、二氧化碳、滅菌去離子水、二甲基亞砜、生理鹽水，其準(zhǔn)備用量如下：以克、毫升、毫米、厘米³為計(jì)量單位；

人體皮膚組織：????????????????????????????????????50g±0.1g

殼聚糖：??????????????????????????????????????????5g±0.01g

明膠：????????????????????????????????????????????5g±0.01g

人體表皮角質(zhì)形成細(xì)胞培養(yǎng)液：Ca²⁺濃度0.09?mmol/L????200mL±1mL

高糖培養(yǎng)基：Ca²⁺濃度1.8mmol/L?????????????????????200mL±1mL

氯化鈣：??????????????????????????????????????????0.5?g±0.001g

碘酒：????????????????????????????????????????????10mL±0.1mL

磷酸鹽溶液：??????????????????????????????????????500mL±5mL

硫酸慶大霉素：40000單位/mL???????????????????????4mL±0.1mL

青霉素：800000單位/g??????????????????????????????5g±0.1g

蛋白酶：??????????????????????????????????????????0.5g±0.?001g

膠原酶：??????????????????????????????????????????0.5g±0.?001g

胎牛血清：????????????????????????????????????????20mL±1mL

胰蛋白酶：????????????????????????????????????????0.5g±0.?001g

乙二胺四乙酸：????????????????????????????????????0.05g±0.?001g

醋酸：????????????????????????????????????????????5mL±0.1mL

戊二醛：濃度50%??????????????????????????????????5mL±0.1mL

氫氧化鈉：???????????????????????????????????????5g±0.1g

硼氫化鈉：???????????????????????????????????????5g±0.1g

二氧化碳：氣體???????????????????????????????????5000cm³±100cm³

滅菌去離子水：???????????????????????????????????1000mL±10mL

二甲基亞砜???????????????????????????????????????2mL±0.1mL

生理鹽水?????????????????????????????????????????100mL±1mL

快速構(gòu)建制備方法如下：

配制細(xì)胞培養(yǎng)液

配制人體真皮成纖維細(xì)胞培養(yǎng)液：

量取高糖培養(yǎng)基90mL，胎牛血清10mL，混勻，成人體真皮成纖維細(xì)胞培養(yǎng)液；

配制人體表皮角質(zhì)形成細(xì)胞與人體真皮成纖維細(xì)胞培養(yǎng)液的混合培養(yǎng)液：

量取人體表皮角質(zhì)形成細(xì)胞培養(yǎng)液100mL、高糖培養(yǎng)基100mL，比例1:1，混勻，加入氯化鈣0.0105g，震蕩搖晃5min，過(guò)濾器過(guò)濾，在冰箱保存，保存溫度4℃，成混合培養(yǎng)液；

人體表皮角質(zhì)形成細(xì)胞與人體真皮成纖維細(xì)胞的提取

手術(shù)獲取人體皮膚組織

選取健康人體，手術(shù)提取人體皮膚組織50g；

將人體皮膚組織置于培養(yǎng)皿中，加入碘酒10mL，迅速進(jìn)行沖洗；

量取磷酸鹽溶液500mL，加入硫酸慶大霉素2mL、青霉素0.125g，過(guò)濾器過(guò)濾，成混合液；將沖洗后的人體皮膚組織置于另一培養(yǎng)皿中，加入磷酸鹽溶液-硫酸慶大霉素-青霉素混合液10mL，浸泡人體皮膚組織，浸泡時(shí)間15min；

用剪刀、刀片刮除人體皮膚組織真皮皮下組織，用磷酸鹽溶液-硫酸慶大霉素-青霉素混合液10mL，浸泡5min；

量取人體表皮角質(zhì)形成細(xì)胞培養(yǎng)液10mL，加入蛋白酶0.025g，搖勻，過(guò)濾器過(guò)濾，將人體皮膚組織表皮面朝上平鋪于無(wú)菌培養(yǎng)皿中，加入人體表皮角質(zhì)形成細(xì)胞培養(yǎng)液-蛋白酶混合溶液10mL，在冰箱4℃下無(wú)菌放置12h；然后用尖鑷分離人體皮膚組織，使表皮與真皮分開；

量取高糖培養(yǎng)基10mL，加入膠原酶0.02g，搖勻，過(guò)濾器過(guò)濾，將人體皮膚組織的真皮組織剪碎，成1mm³塊，加入高糖培養(yǎng)基-膠原酶溶液10mL，置于恒溫培養(yǎng)箱中，在37℃下消化240min，然后加入胎牛血清1mL，混勻，成混合溶液；

離心分離人體真皮成纖維細(xì)胞，靜置培養(yǎng)

將混合溶液收集于離心管內(nèi)，進(jìn)行離心分離，分離轉(zhuǎn)數(shù)1200r/min，時(shí)間5min，倒掉上清液，加入人體真皮成纖維細(xì)胞培養(yǎng)液5mL，吹勻細(xì)胞，成細(xì)胞懸液；將細(xì)胞懸液收集于培養(yǎng)瓶中，將盛有細(xì)胞懸液的培養(yǎng)瓶置于恒溫培養(yǎng)箱中，在37℃、5?%二氧化碳?xì)怏w下靜置培養(yǎng)，培養(yǎng)時(shí)間72h后，倒掉人體真皮成纖維細(xì)胞培養(yǎng)液，再次加入人體真皮成纖維細(xì)胞培養(yǎng)液5mL，繼續(xù)培養(yǎng)時(shí)間72h；

量取磷酸鹽溶液100mL，加入胰蛋白酶0.25g、乙二胺四乙酸0.01g，搖勻，過(guò)濾器過(guò)濾，將人體皮膚組織的表皮組織剪碎，成1mm³塊，加入磷酸鹽溶液-胰蛋白酶-乙二胺四乙酸混合液10mL，置于恒溫培養(yǎng)箱中，在37℃下消化5min；

離心分離人體表皮角質(zhì)形成細(xì)胞，靜置培養(yǎng)

用200目不銹鋼篩網(wǎng)過(guò)濾表皮碎片，與混合液混合，收集于離心管內(nèi)，進(jìn)行離心分離，分離轉(zhuǎn)數(shù)1200r/min，時(shí)間5min，倒掉上清液，加入人體表皮角質(zhì)形成細(xì)胞培養(yǎng)液5mL，吹勻細(xì)胞，成細(xì)胞懸液；將細(xì)胞懸液收集于培養(yǎng)瓶中，將盛有細(xì)胞懸液的培養(yǎng)瓶置于恒溫培養(yǎng)箱中，在37℃、5?%二氧化碳?xì)怏w下靜置培養(yǎng)72h后，倒掉人體表皮角質(zhì)形成細(xì)胞培養(yǎng)液，再次加入人體表皮角質(zhì)形成細(xì)胞培養(yǎng)液5mL，持續(xù)培養(yǎng)時(shí)間72h；

制備殼聚糖-明膠膜片

配制醋酸水溶液

量取醋酸1mL，滅菌去離子水99mL，放入燒杯中，混勻，成醋酸水溶液；

溶解殼聚糖

稱取殼聚糖4g，加入醋酸水溶液96mL，攪拌4h，使其溶解，成殼聚糖醋酸水溶液；

配制明膠水溶液

稱取明膠4g，量取滅菌去離子水96mL，置于燒杯中，然后置于水浴箱中，加熱溫度40℃，使其溶解，成溶解液；

將溶解液用100目濾紙過(guò)濾，得明膠水溶液；

配制殼聚糖-明膠溶液

量取殼聚糖醋酸水溶液95mL，明膠水溶液95mL，比例1:1，加入燒杯中，磁力攪拌60min，

然后置于水浴箱中，在40℃恒溫混勻12h，成殼聚糖-明膠溶液；

配制戊二醛水溶液

量取戊二醛0.08mL，量取滅菌去離子水15.92mL，混勻，成0.05mol/L的戊二醛水溶液；

殼聚糖-明膠溶液中添加戊二醛水溶液

將戊二醛水溶液16mL、殼聚糖-明膠溶液185mL，加入燒杯中，快速攪拌15min，成殼聚糖-明膠-戊二醛混合溶液；

制備水凝膠

將殼聚糖-明膠-戊二醛混合溶液倒入96孔培養(yǎng)板中，孔徑為6mm，在25℃下靜置12h，成水凝膠；

冷凍、冷凍干燥

將水凝膠置于冷凍箱中冷凍，在-20℃冷凍24h，然后在-80℃冷凍24h；

將冷凍的水凝膠置于石英容器中，然后置于冷凍干燥箱中干燥，冷凍干燥溫度-80℃，真空度18Pa，時(shí)間24h，形成?5mm×1mm的圓柱體薄膜；

清洗、還原戊二醛

配制0.25mol/L的氫氧化鈉水溶液100mL；

配制0.26mol/L的硼氫化鈉水溶液100mL；

加入滅菌去離子水100mL，加入燒杯中，成中性混合液；

將冷凍干燥的殼聚糖-明膠薄膜置于中性混合液中浸泡60min，然后將薄膜置于另一燒杯中，加入滅菌去離子水200mL沖洗薄膜，使薄膜的pH=7，呈中性；

沖洗后薄膜置于冷凍箱中冷凍，在-20℃冷凍24h，然后在-80℃冷凍24h；將冷凍的薄膜置于石英容器中，然后在冷凍干燥箱中干燥，冷凍干燥溫度-80℃，真空度18Pa，時(shí)間24h；

γ射線輻射滅菌

將殼聚糖-明膠薄膜裝入密封玻璃瓶中，用γ射線輻射滅菌，γ射線輻射劑量25kgy，滅菌時(shí)間24h，滅菌后薄膜為無(wú)菌保存；

（4）人體表皮組織的快速構(gòu)建和制備

人體表皮組織的快速構(gòu)建和制備是在高壓釜內(nèi)，在氣體壓力中進(jìn)行的，是在37℃下、3.4KPa壓力下、無(wú)菌狀態(tài)下完成的；

將殼聚糖-明膠薄膜置于培養(yǎng)皿中，加入人體表皮角質(zhì)形成細(xì)胞培養(yǎng)液10mL、人體真皮成纖維細(xì)胞培養(yǎng)液10mL，置于恒溫培養(yǎng)箱中，加熱溫度37℃，恒溫培養(yǎng)12h；

將濕潤(rùn)的殼聚糖-明膠薄膜置于無(wú)菌潔凈工作臺(tái)上吹干；

接種細(xì)胞

倒掉培養(yǎng)瓶中的人體表皮角質(zhì)形成細(xì)胞培養(yǎng)液，在培養(yǎng)瓶中加入磷酸鹽溶液-胰蛋白酶-乙二胺四乙酸混合液5mL，置于恒溫培養(yǎng)箱中，在37℃消化5min，成細(xì)胞懸液，然后收集于離心管中，進(jìn)行離心分離，分離轉(zhuǎn)數(shù)1200r/min，時(shí)間5min，倒掉上清液，加入人體表皮角質(zhì)形成細(xì)胞培養(yǎng)液5mL，吹勻細(xì)胞，成細(xì)胞懸液；將人體表皮角質(zhì)形成細(xì)胞以30萬(wàn)個(gè)/cm²的密度接種于殼聚糖-明膠薄膜上，用人體表皮角質(zhì)形成細(xì)胞培養(yǎng)液浸沒(méi)培養(yǎng)24h；

倒掉培養(yǎng)瓶中的人體真皮成纖維細(xì)胞培養(yǎng)液，在培養(yǎng)瓶中加入磷酸鹽溶液-胰蛋白酶-乙二胺四乙酸混合液5mL，置于恒溫培養(yǎng)箱中，在37℃消化5min，成細(xì)胞懸液，然后收集在離心管中，進(jìn)行離心分離，分離轉(zhuǎn)數(shù)1200r/min，時(shí)間5min，倒掉上清液，加入人體真皮成纖維細(xì)胞培養(yǎng)液5mL，吹勻細(xì)胞，成細(xì)胞懸液；將人體真皮成纖維細(xì)胞以30萬(wàn)個(gè)/cm²的密度接種于殼聚糖-明膠薄膜上，用人體真皮成纖維細(xì)胞培養(yǎng)液浸沒(méi)培養(yǎng)24h，

生成：人體表皮角質(zhì)形成細(xì)胞-殼聚糖-明膠復(fù)合組織塊、人體真皮成纖維細(xì)胞-殼聚糖-明膠復(fù)合組織塊；

將人體真皮成纖維細(xì)胞-殼聚糖-明膠復(fù)合組織塊置于96孔培養(yǎng)板中底層，作為滋養(yǎng)層，將人體表皮角質(zhì)形成細(xì)胞-殼聚糖-明膠復(fù)合組織塊置于96孔培養(yǎng)板上層，每孔中加入人體表皮角質(zhì)形成細(xì)胞與人體真皮成纖維細(xì)胞的混和培養(yǎng)液0.1mL，并施加無(wú)菌空氣與二氧化碳混合氣體，高壓釜內(nèi)底層置放滅菌去離子水，做濕潤(rùn)劑，加熱溫度37℃，氣體壓力3.4KPa，氣體壓力3.4KPa，進(jìn)行氣-液界面壓力培養(yǎng)72h；

氣-液界面壓力培養(yǎng)后，在96孔培養(yǎng)板上合成人體表皮組織；

（5）人體表皮組織的檢測(cè)、分析、表征

對(duì)制備的人體表皮組織的形貌、細(xì)胞生長(zhǎng)、分層進(jìn)行檢測(cè)、分析、表征；

用酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀進(jìn)行人體表皮組織中人體表皮角質(zhì)形成細(xì)胞的增殖情況；

用倒置顯微鏡進(jìn)行人體表皮角質(zhì)形成細(xì)胞排列及分層的檢測(cè)；

結(jié)論：制備的人體表皮組織為無(wú)色薄膜狀，組織成分為人體表皮角質(zhì)形成細(xì)胞-殼聚糖-明膠復(fù)合物，組織活性良好，人體表皮角質(zhì)形成細(xì)胞分層生長(zhǎng)良好；

（6）人體表皮組織的保存

人體表皮角質(zhì)形成細(xì)胞培養(yǎng)液8mL，加入胎牛血清1mL，二甲基亞砜1mL，形成人工表皮保護(hù)液；人體表皮組織置于棕色透明無(wú)菌的塑料容器中，加入保護(hù)液10mL，在4℃放置30min；在-20℃放置30min；在-80℃放置24h；在液氮中長(zhǎng)期保存；

（7）人體表皮組織的復(fù)溫

將盛有保護(hù)液和人體表皮組織的塑料容器置于恒溫水浴箱中，在37℃下解凍5min，人體表皮組織復(fù)溫，用無(wú)菌生理鹽水沖洗人體表皮組織3次，每次1min。

2.根據(jù)權(quán)利的要求1所述的一種人體表皮組織的快速構(gòu)建制備方法，其特征在于：人體表皮組織的快速構(gòu)建制備是在高壓釜內(nèi)、在氣體壓力中進(jìn)行的，是在37℃下、在3.4KPa壓力下、無(wú)菌狀態(tài)下完成的；

高壓釜為矩形，高壓釜（1）下部為電控箱（18）、上部為高壓密封釜蓋（2）；在高壓釜（1）內(nèi)底部為滅菌去離子水（6），高壓釜（1）內(nèi)中間位置安裝支架（3），在支架（3）上置放培養(yǎng)板（4），在培養(yǎng)板（4）上置放人體表皮組織（5），在人體表皮組織（5）上部由混合氣體（7）充填；在高壓密封釜蓋（2）上部由左至右設(shè)置進(jìn)氣管（10）、氣壓表（9）、出氣閥（8），進(jìn)氣管（10）左部連接混合氣體過(guò)濾滅菌裝置（11）、混合氣體進(jìn)氣閥（12），混合氣體進(jìn)氣閥（12）通過(guò)進(jìn)氣管（10）同時(shí)連通二氧化碳?xì)怏w閥（13）、壓縮空氣氣體閥（14），二氧化碳?xì)怏w閥（13）連通二氧化碳?xì)怏w瓶（16），壓縮空氣氣體閥（14）連通空氣壓縮機(jī)（15）；在高壓釜（1）的下部為電控器（18），在電控器（18）上設(shè)有顯示屏（19）、指示燈（20）、電源開關(guān)（21）、加熱溫度控制器（22）、空氣壓縮機(jī)控制器（23）；電控器（18）通過(guò)導(dǎo)線（17）與空氣壓縮機(jī)（15）連接。