[發明專利]一種新型等溫環介導副溶血弧菌核酸標記檢測試劑

無效

• 申請號: 201310736720.X
• 申請日: 2013-12-27
• 公開（公告）號: CN103667502A
• 公開（公告）日: 2014-03-26
• 發明（設計）人: 關淳;王馨;祁軍;左鋒;劉寅
• 申請（專利權）人: 天津國際旅行衛生保健中心
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;C12Q1/04
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

技術領域

本發明涉及一種應用于核酸檢測的試劑，具體講，涉及一種新型等溫環介導副溶血弧菌核酸標記檢測試劑。

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背景技術

副溶血弧菌是革蘭氏陰性多形態桿菌或稍彎曲弧菌。副溶血性弧菌食物中毒也稱嗜鹽菌食物中毒，是進食含有該菌的食物所致，主要來自海產品或鹽腌漬品，常見者為蟹類、烏賊、海蜇、魚、黃泥螺等，其次為蛋品、肉類或蔬菜。臨床上以急性起病、腹痛、嘔吐、腹瀉及水樣便為主要癥狀。副溶血弧菌的快速檢測對其引起的疾病防控具有重要的意義。

環介導等溫擴增技術（Loop-mediated?isothermal?amplification）是一種新型的核酸檢測技術，其特點是針對靶基因的6個區域設計4種特異引物，在鏈置換DNA聚合酶(Bst?DNA?polymerase)的作用下，在60℃～65℃恒溫擴增，?60分鐘左右即可實現10⁹～10¹⁰倍的核酸擴增，具有操作簡單、特異性強等特點。該技術的優勢除了高特異性、高靈敏度外，操作十分簡單，對儀器設備要求低，一臺水浴鍋或恒溫箱就能實現反應。其擴增結果可以通過凝膠電泳、肉眼觀察焦磷酸鎂沉淀或加入熒光物質后的顏色改變來做初步的判斷。但該方法也有一定的缺陷，主要表現在擴增結果檢測環節，凝膠電泳檢測容易造成污染，焦磷酸鎂沉淀檢測靈敏度較差，熒光物質變色方法受到熒光物質的成本或者需要使用檢測儀器的限制。因此，在產物檢測環節的限制，影響了該技術的推廣應用。

本發明公開了一種新型的等溫環介導副溶血弧菌核酸標記檢測試劑。該方法具有本發明的相對傳統環介導等溫核酸擴增技術具有靈敏度更高，結果判斷更準確的優勢。

發明內容

本發明的首要發明目的在于提供一種新型等溫環介導副溶血弧菌核酸標記檢測試劑。

本發明的第二發明目的在于提供一種新型等溫環介導副溶血弧菌核酸標記檢測方法。

本發明的第三發明目的在于提供這種新型等溫環介導副溶血弧菌核酸標記檢測試劑盒的應用。

發明的主要技術方案為：

1.?等溫環介導副溶血弧菌核酸標記檢測試劑的組成為：

（1）核酸恒溫標記擴增反應試劑

核酸恒溫擴增反應液中含有前外引物、后外引物、前促環引物、后促環引物、前內引物、后內引物、dNTPs溶液、具有鏈置換活性的DNA聚合酶（如：Bst?DNA聚合酶等）、MgSO₄、無菌雙蒸水以及環介導等溫擴增的緩沖液。

環介導等溫擴增的緩沖液的最終工作濃度為20?mM?Tris-HCl、10?mMKCl、10?mM??(NH₄)₂SO₄、2?mM?MgSO₄以及質量濃度為0.1%?Triton?X-100，緩沖液的pH值為8.8。

其中前外引物、后外引物、前促環引物、后促環引物、前內引物、后內引物均為人工合成的脫氧核糖核酸分子，其中前外引物的核苷酸序列為SEQ?ID?NO:1、后外引物的核苷酸序列為SEQ?ID?NO:2、前促環引物的核苷酸序列為SEQ?ID?NO:3、后促環引物的核苷酸序列為SEQ?ID?NO:4、前內引物的核苷酸序列為SEQ?ID?NO:5、后內引物的核苷酸序列為SEQ?ID?NO:6，上述引物分別與待測基因的相應位置互為反義互補序列，上述引物能夠在等溫條件下以環介導的方式檢測待測基因。將前內引物的5’端標記上生物素基團，將后內引物的5’端標記上異硫氰酸熒光素基團。

各引物的具體核苷酸序列如下：

SEQ?ID?NO:1?5’-?AGCTACTCGAAAGATGATCC?-3’,

SEQ?ID?NO:2?5’-?GGTTGTATGAGAAGCGATTG?-3’,

SEQ?ID?NO:3?5’-?ACCAGTAGCCGTCAATG?-3’,

SEQ?ID?NO:4?5’-?TTAGATTTGGCGAACGAGA?-3’,

SEQ?ID?NO:5?5’-?ATGTTTTTAAATGAAACGGAGCTCCGGCAAAAAACGAAGATGGT?-3’,

SEQ?ID?NO:6?5’-?ACGTCGCAAAACGTTATCCGGCGAAGAACGTAATGTCTG?-3’。

（2）標記核酸膠體金檢測試紙條