[發明專利]快速高效獲得蕓薹屬蔬菜游離小孢子培養再生植株的方法

有效

• 申請號: 201310726458.0
• 申請日: 2013-12-25
• 公開（公告）號: CN103718965A
• 公開（公告）日: 2014-04-16
• 發明（設計）人: 李英;劉環環;侯喜林;劉同坤
• 申請（專利權）人: 南京農業大學
• 主分類號: A01H4/00
• 分類號: A01H4/00
• 代理公司: 南京天華專利代理有限責任公司 32218
• 代理人: 徐冬濤;尹慧晶

1.一種快速高效獲得蕓薹屬蔬菜游離小孢子培養再生植株的方法，其特征在于：包括如下步驟：?

(1)花蕾的選擇、預處理和滅菌：在初花期和盛花期，選取發育時期為單核靠邊期的花蕾；將花蕾保濕并置于冰箱中冷藏靜置24h后滅菌；?

(2)小孢子分離與純化：向滅菌后的花蕾中加入B5-13液體培養基，采用擠壓法使小孢子游離出來，然后過濾，收集濾液，離心，棄上清液，得到純化后的小孢子；所述的花蕾與B5-13液體培養基的比例為每28-32個花蕾中加入1～2ml的B5-13液體培養基。?

(3)培養液的分裝、熱激誘導：將純化后的小孢子用含有13%蔗糖的1/2NLN液體培養基重新懸浮，然后分裝，小孢子密度1蕾/ml，封口后、熱激誘導；?

(4)胚狀體形成：將熱激后的小孢子懸浮液于25℃黑暗靜置培養，2～3周后出現肉眼可見的胚狀體；?

(5)振蕩培養：將上述胚狀體轉到2000lx、25℃、60r/min搖床上振蕩培養；?

(6)誘導再生植株：振蕩培養3～7d后將轉綠的子葉型胚轉移到含蔗糖2.5%，瓊脂1%的B5固體培養基上繼續培養獲得再生芽，15～20d后，將其轉入含10%椰汁，3%蔗糖，0.78%瓊脂的MS固體培養基中，培養20～30d。?

2.根據權利要求1所述的快速高效獲得蕓薹屬蔬菜游離小孢子培養再生植株的方法，其特征在于：單核靠邊期對應的花蕾長度不結球白菜為2.0～3.0mm，青花菜為3.0mm～4.0mm。?

3.根據權利要求1所述的快速高效獲得蕓薹屬蔬菜游離小孢子培養再生植株的方法，其特征在于：所述的B5-13液體培養基為小孢子提取液，是通過以下方法制備得到的：分別吸取B5培養基的大量元素50ml、微量元素5ml、鐵鹽10ml、有機元素10ml四種母液混合到500ml蒸餾水中，混勻，再加入130g蔗糖，攪拌至完全溶解，定容至1000ml，然后調pH至6.0～6.2；于121℃，1.1Mpa條件下滅菌20分鐘。?

4.根據權利要求1所述的快速高效獲得蕓薹屬蔬菜游離小孢子培養再生植株的方法，其特征在于：所述的1/2NLN液體培養基是通過以下方法制備得到的：分別吸取NLN培養基的大量元素25ml、微量元素5ml、鐵鹽10ml、有機元素10ml四種母液混合到500ml蒸餾水中，混勻，再依次加入肌醇0.1g、谷氨酰胺0.8g、絲氨酸0.1g、谷胱甘肽0.03g、蔗糖130g，攪拌至完全溶解后，定容至1000ml，然后調pH至6.0～6.2；采用0.22μm的微孔?濾膜抽濾滅菌。?

5.根據權利要求1所述的快速高效獲得蕓薹屬蔬菜游離小孢子培養再生植株的方法，其特征在于：所述的B5固體培養基是通過以下方法制備得到的：分別吸取B5培養基的大量元素50ml、微量元素5ml、鐵鹽10ml、有機元素10ml四種母液混合到500ml蒸餾水中，混勻，再加入25g蔗糖，攪拌至完全溶解，定容至1000ml，加熱至沸騰后，加入10g瓊脂粉，攪拌至完全溶解，調pH至5.8～6.0；在121℃，1.1Mpa條件下滅菌20分鐘。?

6.根據權利要求1所述的快速高效獲得蕓薹屬蔬菜游離小孢子培養再生植株的方法，其特征在于：所述的MS固體培養基是通過以下方法制備得到的：分別吸取MS培養基的大量元素50ml、微量元素5ml、鐵鹽10ml、有機元素10ml四種母液，椰汁100ml混合到500ml蒸餾水中，混勻，再加入30g蔗糖，攪拌至完全溶解，定容至1000ml，加熱至沸騰后，加入7.8g瓊脂粉，攪拌至完全溶解，調pH至5.8～6.0；在121℃，1.1Mpa條件下滅菌20分鐘。?

7.根據權利要求1所述的快速高效獲得蕓薹屬蔬菜游離小孢子培養再生植株的方法，其特征在于：步驟(6)中再生植株的培養條件都為90uE/m²/s、12hr/d、25℃。?

8.根據權利要求1所述的快速高效獲得蕓薹屬蔬菜游離小孢子培養再生植株的方法，其特征在于所述的滅菌步驟是將預處理后的花蕾依次用體積濃度為75％的酒精和7％(v/v)的NaClO溶液消毒，無菌水沖洗。?

9.根據權利要求1所述的快速高效獲得蕓薹屬蔬菜游離小孢子培養再生植株的方法，其特征在于所述的熱激誘導是將小孢子懸浮液置于33℃高溫下黑暗靜置24h。?

10.根據權利要求1所述的快速高效獲得蕓薹屬蔬菜游離小孢子培養再生植株的方法，其特征在于所述的花蕾的選擇是通過醋酸洋紅壓片法鏡檢確定小孢子的發育時期及與花蕾長度的對應關系，準確找到發育時期為單核靠邊期的花蕾。?