[發明專利]一種鹽酸高血糖素的純化方法

有效

• 申請號: 201310717379.3
• 申請日: 2013-12-20
• 公開（公告）號: CN103694338B
• 公開（公告）日: 2018-04-06
• 發明（設計）人: 趙忠衛;潘俊鋒;馬亞平;袁建成
• 申請（專利權）人: 深圳翰宇藥業股份有限公司
• 主分類號: C07K14/605
• 分類號: C07K14/605;C07K1/36;C07K1/30;C07K1/20;C07K1/16
• 代理公司: 北京北翔知識產權代理有限公司11285
• 代理人: 孫占華,張廣育

技術領域

本發明涉及一種鹽酸高血糖素的純化方法。具體而言，本發明涉及一種操作簡單、高收率、純度高、有利于實現產業化的鹽酸高血糖素的純化方法。

背景技術

高血糖素（glucagon）亦稱增血糖素或抗胰島素或胰島素B。它是伴隨胰島素由脊椎動物胰臟的胰島α細胞分泌的一種激素。與胰島素相對抗，起著增加血糖的作用。高血糖素是由29個氨基酸組成的直鏈多肽，分子量為3485，它是由一個大分子的前體裂解而來。目前國內有兩家產品上市，分別是丹麥諾和諾德公司的注射用生物合成高血糖素和深圳翰宇的注射用鹽酸高血糖素。其在鹽酸鹽的條件下具有較高的生物活性。

目前高血糖素的生產主要采用生物重組方法，其收率不高，純度也較低，一般在90%左右。關于高血糖素人工合成方法方面的文獻很少，關于純化的文獻幾乎沒有。

本發明的目的是提供一種操作簡單、高收率、純度高、有利于實現產業化的鹽酸高血糖素的純化方法。

發明內容

為實現上述目的，綜合考慮鹽酸高血糖素本身的性質，本發明提供了一種鹽酸高血糖素的純化方法，包括以下步驟：

—以體積比30%—60%的醋酸和5%—20%的乙腈的水溶液溶解粗肽，得到粗肽溶液；

—將所得粗肽溶液采用色譜法梯度洗脫純化，以體積比0.1%—0.4%的硫酸和體積比0.1%—0.4%高氯酸的水溶液用氨水調pH值2.5—3.5后的溶液為A相，乙腈為B相，梯度：B%：20%—45%，優選20%-40%洗脫，收集洗脫得到的高血糖素硫酸鹽溶液；

—使所得高血糖素硫酸鹽溶液鹽析；

—在十八烷基硅烷鍵合硅膠色譜柱上采用反相高效液相色譜法將鹽析后的樣品轉鹽和脫鹽，以0.1～0.8%（w/v）的醋酸銨水溶液為A相，乙腈為B相，梯度：B%：3%～10%梯度或等度沖洗15～30分鐘后，再用鹽酸水溶液--乙腈體系脫鹽處理。

具體而言，本發明提出了一種鹽酸高血糖素的純化方法，該方法獲得的產品純度高且收率好，能夠達到產業化要求。

在一個實施方案中，本發明提供的一種高血糖素鹽酸鹽的純化方法包括以下步驟：

步驟1）：以體積比30%—60%的醋酸和5%—20%的乙腈的水溶液按照濃度20g/L—50g/L溶解粗肽，用水將所得粗肽溶液中的醋酸與乙腈二者的總體積百分數稀釋到10%—30%。步驟1）下文也表述為“前處理”。

所述“粗肽”是指采用液相合成法或固相合成法得到的，尚未經過精制處理的鹽酸高血糖素粗肽或者純度不能滿足藥用的鹽酸高血糖素，粗肽中鹽酸高血糖素的純度在20%以上。

所述“粗肽溶液”是指粗肽經過前處理后所得到的溶液，所使用的水為純凈水，并符合注射用水標準，優選超純水；所使用的醋酸為分析純的冰醋酸，本發明的“乙腈”的純度級別優選色譜純。

選擇體積比30%—60%的醋酸和5%—20%的乙腈的水溶液混合溶劑系統是通過對比試驗并考慮實際生產過程的操作方便得出的，不在該濃度范圍內的溶劑的溶解能力會變低，導致溶解樣品所需的溶解體積過大，不利于反相色譜的處理（會導致體積過載，純化效率低）。

將制備的粗肽的濃度控制在20g/L—50g/L有利于純化效率，高于50g/L會導致后續的反相色譜純化時不掛色譜柱，低于20g/L會使純化效率低下。

用水將所得粗肽溶液中的醋酸與乙腈二者的總體積百分數稀釋到10%—30%，當醋酸和乙腈的總體積百分數高于30%此范圍的溶劑會導致后續的反相色譜純化時不掛色譜柱，當醋酸和乙腈的總體積百分數低于10%會使樣品析出，導致后續的反相色譜純化無法進行。

步驟2）：將所得粗肽溶液進行色譜法梯度洗脫純化，以0.1%—0.4%的硫酸和0.1%—0.4%高氯酸的水溶液（體積比，用氨水調pH值2.5—3.5）為A相，乙腈為B相，梯度：B%：20%—45%，優選20%-40%，收集純化的高血糖素硫酸鹽溶液；步驟2）下文也表述為“純化”。在一個優選的實施方案中，所述pH為3.0。

選擇0.1%—0.4%的硫酸和0.1%—0.4%高氯酸兩種酸用氨水調節后生成兩種緩沖鹽的A相是優化選擇的結果。流動相A中緩沖鹽的濃度低于所限定的范圍使流動相緩沖能力變弱，導致樣品不能完全洗脫且譜圖變形達不到分離的要求。大于此范圍，流動相A中緩沖鹽的濃度過高對色譜系統損傷較大，甚至會部分產生鹽析，導致無法純化。另外，流動相A的pH值也非常重要，不在2.5—3.5范圍達不到分離效果。