[發明專利]一種制備hEGF粗制品的方法

有效

• 申請號: 201310715778.6
• 申請日: 2013-12-23
• 公開（公告）號: CN103694334A
• 公開（公告）日: 2014-04-02
• 發明（設計）人: 苗丕渠;蘇古方;吳蓉蓉;侯曉彥
• 申請（專利權）人: 揚州艾迪生物科技有限公司
• 主分類號: C07K14/485
• 分類號: C07K14/485;C07K1/36;C07K1/34;C07K1/30;C07K1/18;C07K1/16
• 代理公司: 南京蘇高專利商標事務所(普通合伙) 32204
• 代理人: 謝東

技術領域

本發明涉及一種尿蛋白的提取方法，尤其涉及一種hEGF粗制品的制備方法。

背景技術

人尿中含有三百多種蛋白質，尿激酶、人尿胰蛋白酶抑制劑、人尿激肽原酶等都已經從人尿中分離出來，并在疾病治療等領域發揮了重要的作用。

人表皮生長因子（Human?Epidernal?Growth?Factor，又叫Urogastrone，尿抑胃素，以下簡稱為hEGF），于70年代首次從人尿中分離。hEGF是人生長因子中的一種，是由53個氨基酸組成的相對分子量為6045Da，等電點為4.6左右的小分子多肽。hEGF含有三對分子內二硫鍵，因此對酸、堿、熱等理化因素均較穩定。目前，hEGF已被開發成治療抑制胃酸分泌的注射劑和燒燙傷、潰瘍、各類創傷以及角膜損傷的外用藥物和美容護膚品。

中國人尿資源非常豐富，依賴于這一有利條件，尿蛋白產業從上世紀七十年代末就已經開始發展起來，至今已有三十多年。在尿蛋白粗制品的規模化生產方式主要有兩種，方法一：收集尿液，運輸到加工點，用吸附劑吸附尿蛋白，由于尿液來源分散，收集成本高，加上城市衛生改造，收集已經越來越困難；方法二：直接將吸附尿蛋白的樹脂放置在廁所進行連續在線吸附，然后收集吸附后的樹脂運回加工點進行分離純化。這種方法對環境無污染，可以在大中城市進行收集，尿源集中，運輸成本較低，極大地擴大了尿蛋白的收集區域。

尿蛋白產品目前主要的生產過程是：首先，在各地經過尿蛋白的吸附、洗脫、沉淀等步驟制備尿蛋白粗制品；其次，尿蛋白粗制品經過下游的分離純化和精制，制備尿蛋白原料藥；最后灌裝成品制劑，用于臨床。

目前，hEGF來源有兩種。第一，hEGF主要通過基因工程制備，名稱為重組hEGF（Recombind?Human?Epidermal?Growth?Factor，以下簡稱rhEGF）。主要的制備途徑有原核表達、哺乳動物細胞表達、酵母表達等，通過收集發酵液，進行分離純化得到rhEGF。第二，從人尿中分離提取hEGF。目前，主要是從孕婦尿液中經過復雜的純化過程得到hEGF。

通過基因工程制備的rhEGF雖然易純化、產量高，但由于其中存在微量的異源蛋白，rhEGF容易引起過敏反應，因此，目前只作為外用藥物使用。從尿液中制備的hEGF，結構和性質和人體完全相同，不存在異源蛋白，可作為注射劑進入臨床。目前國外已經有進行臨床研究的案例。但是hEGF目前多數從孕婦尿中分離得到，孕婦尿難于收集且產量低，限制了hEGF的應用。

發明內容

本發明的目的是針對現有技術存在的不足，提供一種從男性尿液中制備hEGF粗制品的方法，該粗制品可用于hEGF的后續純化，純化出的hEGF不含使人體產生過敏反應的異源蛋白，該方法操作簡便便于工業化生產出hEGF粗制品，為從自然來源中提取hEGF提供基礎。

為實現上述目的，本發明制備hEGF粗制品的方法的技術方案是：

一種制備hEGF粗制品的方法，收集吸附尿蛋白后的吸附劑，集中洗脫，將洗脫出的尿蛋白溶液上樣已平衡好的金屬螯合層析柱，收集含有hEGF組分的洗脫峰，經過硫酸銨沉淀，制備hEGF粗制品。

所述的制備hEGF粗制品的方法，包括如下步驟：

1）?將陰離子交換樹脂作為吸附劑放置在公共廁所的尿池或尿斗中，吸附流經尿液或稀釋尿液中的尿蛋白；

2）?收集已吸附尿蛋白的樹脂，進行清洗、解吸處理；

3）?超濾濃縮；

4）?超濾濃縮液調節pH和電導，上樣已平衡好的金屬螯合層析柱，再用平衡液沖洗；

5）?用洗脫溶液洗脫，收集含有hEGF組分的洗脫峰；

6）??在收集的洗脫峰中加入硫酸銨粉末至飽和，靜置2－10小時后，收集沉淀，得到hEGF粗制品。

所述的金屬螯合層析柱螯合的金屬離子是Cu²⁺、Zn²⁺、Ni²⁺、Fe³⁺中的任意一種。優選Cu²⁺。

金屬螯合層析柱平衡液為0.01－0.2M磷酸鹽緩沖液，NaCl濃度為0.2－2.0M，pH6.0-8.0。優選0.02M磷酸鹽緩沖液，NaCl濃度為0.5M。

所述的金屬螯合層析柱洗脫溶液為0.05-0.2M磷酸鹽緩沖液，NH₄Cl濃度為0.5-1.0M，pH6.0-8.0。優選0.1M磷酸鹽緩沖液，0.8M的NH₄Cl，pH7.5。