[發(fā)明專利]一種制備漆酶的方法

在審

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201310712411.9
• 申請(qǐng)日: 2013-12-16
• 公開（公告）號(hào): CN104711234A
• 公開（公告）日: 2015-06-17
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 姜文俠;孫瑞雪;劉琦;李曉輝;楊萍
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 中國(guó)科學(xué)院天津工業(yè)生物技術(shù)研究所
• 主分類號(hào): C12N9/02
• 分類號(hào): C12N9/02;C12R1/645
• 代理公司: 天津市北洋有限責(zé)任專利代理事務(wù)所 12201
• 代理人: 陸藝

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域。更具體地涉及利用一株虎皮香菇（Lentinus?tigrinus）液體深層發(fā)酵生產(chǎn)漆酶的方法。

背景技術(shù)

漆酶是一種含銅的多酚氧化酶，與植物中的抗壞血酸氧化酶、哺乳動(dòng)物的血漿銅藍(lán)蛋白屬銅藍(lán)氧化酶（blue?copper?oxidases）家族中的同一小族。漆酶按其來(lái)源可以分為漆樹漆酶（rhus?laccase）和真菌漆酶（fungal?laccase）兩大類，植物漆酶與木質(zhì)素的生物合成密切相關(guān)，真菌漆酶具有多種生理生化功能，如形態(tài)發(fā)生，真菌與植物寄主相互作用，應(yīng)激防御以及木質(zhì)素降解等。據(jù)統(tǒng)計(jì)漆酶的催化底物多達(dá)250多種，主要有酚類、芳胺、羧酸、金屬有機(jī)化合物以及一些甾類激素和生物色素。由于作用底物廣泛，漆酶在食品工業(yè)、廢水處理、紙漿漂白、土壤凈化、染料脫色、有機(jī)合成、木材加工、免疫檢測(cè)等諸多領(lǐng)域有廣泛應(yīng)用。

己經(jīng)發(fā)現(xiàn)了有多種產(chǎn)漆酶的側(cè)耳類真菌，如糙皮側(cè)耳、刺芹側(cè)耳、環(huán)柄側(cè)耳等，但漆酶酶活普遍不高。發(fā)明專利申請(qǐng)CN200910083514.7“一種漆酶及其制備方法與專用生產(chǎn)菌株”，其生產(chǎn)菌株為血紅密孔菌，漆酶發(fā)酵酶活為300U/mL；發(fā)明專利申請(qǐng)CN101942421B“一種竹黃菌發(fā)酵生產(chǎn)漆酶的方法”，漆酶發(fā)酵酶活為500U/mL；發(fā)明專利申請(qǐng)CN200810198678.X“一種產(chǎn)漆酶的靈芝菌株”，漆酶發(fā)酵酶活為8620U/mL，是目前酶活較高的菌株。上述發(fā)明的菌種不屬于食用菌。

虎皮香菇，屬傘菌目，側(cè)耳科，香菇屬，生于闊葉樹腐木上，易于進(jìn)行固體栽培和液體深層發(fā)酵培養(yǎng)，具有生長(zhǎng)迅速，產(chǎn)物產(chǎn)量高，是一種食用真菌。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的是提供一種利用食用菌制備漆酶的方法。

本發(fā)明的技術(shù)方案概述如下：

一種制備漆酶的方法，包括如下步驟：

（1）將接種虎皮香菇（Lentinus?tigrinus）保藏編號(hào)：CGMCC?No.8301的斜面培養(yǎng)基的固體菌種接種至液體種子培養(yǎng)基，在25～35℃，搖床150～200rpm，培養(yǎng)2～5天，制備種子液；

（2）將種子液按體積比為2%～14%的接種量接種至發(fā)酵培養(yǎng)基，所述發(fā)酵培養(yǎng)基是在500mL三角瓶中的裝液量為100～250mL，在25～35℃、搖床150～350rpm培養(yǎng)7～20天，得到虎皮香菇菌絲體發(fā)酵液；

（3）將菌絲體發(fā)酵液于10000×g離心10min，取上清液即為漆酶粗酶液。

步驟（1）優(yōu)選為：將接種虎皮香菇（Lentinus?tigrinus）保藏編號(hào)：CGMCC?No.8301的斜面培養(yǎng)基的固體菌種接種至液體種子培養(yǎng)基，在28～32℃，搖床150～200rpm，培養(yǎng)3～4天，制備種子液。

步驟（2）優(yōu)選為：將種子液按體積比為6%～14%的接種量接種至發(fā)酵培養(yǎng)基，所述發(fā)酵培養(yǎng)基是在500mL三角瓶中的裝液量為150～200mL，在28～32℃，搖床150～200rpm，培養(yǎng)9～15天，得到虎皮香菇菌絲體發(fā)酵液。

斜面培養(yǎng)基優(yōu)選為：葡萄糖5～40g/L，蛋白胨2.5～20g/L，酵母粉0.5～5g/L，瓊脂10～20g/L，其余為花生殼浸出液；所述的花生殼浸出液的制備方法為：花生殼10～200g，水1L，煮沸30～60min，過(guò)濾，濾液即是花生殼浸出液。

液體種子培養(yǎng)基為：玉米粉10～50g/L、豆粕粉5～35g/L、α-淀粉酶20～80U/L、KH₂PO₄0.5～6g/L、MgSO₄·7H₂O0.2～5g/L，其余為水，pH自然，0.1MPa滅菌25min。

液體種子培養(yǎng)基較好的是：玉米粉25～35g/L、豆粕粉10～20g/L、α-淀粉酶30～65U/L、KH₂PO₄2～4g/L、MgSO₄·7H₂O1～2g/L，其余為水，pH自然，0.1MPa滅菌25min。

發(fā)酵培養(yǎng)基為：碳源20～100g/L，氮源5～60g/L，KH₂PO₄1～5g/L，MgSO₄·7H₂O0.25～3g/L，CuSO₄·5H₂O0.5～2mmol/L，其余為水。

碳源選自以下一種或幾種：葡萄糖、果糖、木糖、麥芽糊精、麥芽糖或玉米粉。