[發明專利]一種利用常壓室溫等離子體制備微生物感受態細胞的方法有效

申請號：	201310700136.9	申請日：	2013-12-18
公開（公告）號：	CN103710335A	公開（公告）日：	2014-04-09
發明（設計）人：	畢鮮榮;王立言	申請（專利權）人：	無錫思清源生物科技有限公司
主分類號：	C12N13/00	分類號：	C12N13/00
代理公司：	北京海虹嘉誠知識產權代理有限公司 11129	代理人：	吳泳歷
地址：	214135 江蘇省無錫***	國省代碼：	江蘇;32
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摘要：
搜索關鍵詞：	一種利用常壓室溫等離子體制備微生物感受態細胞方法
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【說明書】：

技術領域

本發明屬于等離子體技術在生物學領域的應用，具體涉及一種利用常壓室溫等離子體制備微生物感受態細胞的方法。

背景技術

使帶有遺傳信息的DNA分子進入宿主細胞的過程稱為“轉化”；經過物理或化學方式的處理而具有容易接受外來DNA分子進入的宿主細胞，稱為“感受態細胞”。感受態細胞的狀態直接影響轉化的效率，為了使宿主細胞進行特定DNA或蛋白質的復制或表達，獲得易于轉化的感受態細胞是關鍵。

制備感受態細胞的方法主要包括物理方法和化學方法兩大類。其中較常用的物理方法包括電刺激、超聲波、滲透壓等；化學方法包括CaCl₂、RbCl(KCl)、Inoue法等。然而，化學方法往往存在轉化效率較低、處理過程繁瑣、對環境污染等問題，而物理方法普遍能耗較高、細胞生存率低。因此，研究一種轉化效率高、操作簡單實用并且成本低廉的方法用于感受態細胞的制備，對分子生物學的研究尤為必要。

等離子體是物質的第四態，由大量的分子、原子、離子和電子等粒子組成的體系，化學活性高而宏觀上呈電中性。這種條件溫和、能量密度高的技術逐漸應用于感受態細胞的制備，如發明“一種利用大氣壓冷等離子體提高細胞膜通透性的方法”（公告號：CN102321606A），即利用大氣壓介質阻擋放電（Atmospheric-Pressure?Dielectric?Barrier?Discharge,APDBD）等離子體處理微生物細胞懸浮液，達到了提高細胞膜通透性的目的。然而DBD放電不夠均勻，使得其應用受到限制。

常壓室溫等離子體（Atmospheric?and?Room?Temperature?Plasma,ARTP）由于去除了介質覆蓋，與APDBD相比放電更加均勻，并且發生器結構簡單、成本低，所產生等離子體射流的溫度接近室溫，而臭氧濃度及紫外線輻射強度非常低。ARTP富含激發態的氦原子、氧原子、氮原子、OH自由基等能量離子，能夠與微生物細胞內的蛋白質和遺傳物質相互作用，最終引起細胞性質的改變，使細胞處于最適攝取和容納外來DNA的生理狀態。然而，現有技術中并未有關于利用常壓室溫等離子體制備微生物感受態細胞的報道。

發明內容

本發明的目的在于提供一種利用常壓室溫等離子體制備微生物感受態細胞的方法。該方法具有簡單、方便、高效、經濟、實用的特點，特別適用于微生物感受態細胞的制備。

本發明的技術方案如下：

一種利用常壓室溫等離子體制備微生物感受態細胞的方法，其特征在于，制備時，使微生物細胞懸浮液經等離子體照射，收集，即得感受態細胞。

所述等離子體為常壓室溫等離子體，由ARTP誘變育種系統采用裸露金屬電極在大氣壓、室溫條件下產生的均勻輝光放電等離子體。

所述ARTP誘變育種系統，以氦氣、氬氣、氮氣、氧氣、空氣或其混合氣體為氣源。

所述ARTP誘變育種系統的參數為：所述氣源為氦氣、氬氣或其混合氣體為氣源，氣體流量設定為3～30SLM（Standard?Liter?per?Minute，公升/分鐘），功率為50～150W。此參數范圍內，等離子體放電均勻有效。

所述氣體流量設定為5～15SLM、功率為80～120W，此參數范圍內，等離子體放電均勻度最佳，效果最好。

所述液體循環系統通過蠕動泵調整流速，每個循環處理時間為0～20s，該濃度范圍基本能滿足制備感受態細胞的要求。

每個循環處理時間為5～15s，此范圍內既可獲得大量的感受態細胞，又不會對細胞膜造成損傷；所述微生物細胞懸浮液為細菌細胞懸浮液、放線菌細胞懸浮液、真菌細胞懸浮液、藻類細胞懸浮液或藻類原生質體細胞懸浮液。

上述方法包括如下步驟：

1）從微生物生長的固體平板上挑選新活化的微生物單菌落接種于液體培養基中，震蕩培養過夜，得菌液；