[發(fā)明專利]用于基因組DNA永久保存的接頭及方法

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• 申請?zhí)枺?/td>: 201310689316.1
• 申請日: 2013-12-16
• 公開（公告）號: CN103849617A
• 公開（公告）日: 2014-06-11
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 覃振東
• 申請（專利權(quán)）人: 復(fù)旦大學(xué);江蘇基譜生物科技發(fā)展有限公司
• 主分類號: C12N15/11
• 分類號: C12N15/11;C12N15/10
• 代理公司: 北京集佳知識產(chǎn)權(quán)代理有限公司 11227
• 代理人: 趙青朵;馮瓊

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及用于基因組DNA永久保存的接頭及方法。

背景技術(shù)

DNA是染色體的重要組成成分，是真核生物的遺傳基本物質(zhì)，含有物種個體的遺傳信息，可用于構(gòu)建基因文庫、分離所需的基因和檢測相關(guān)的分子標記等。由于DNA所含的遺傳信息量大，并且容易獲取，具有極其穩(wěn)定的化學(xué)性質(zhì)，是目前種質(zhì)資源和遺傳資源收集和保存的主要內(nèi)容之一。DNA分子的序列結(jié)構(gòu)具有三個重要特性：（1）不同個體序列不一樣；（2）終生不變；（3）同一人體各不同部位細胞中的DNA序列相同，因此DNA分子本身具備檔案的特性，即具有長期穩(wěn)定性、信息屬性、個體特異性和可以備查的屬性。實際上，在疾病基因組學(xué)、藥物基因組學(xué)、群體遺產(chǎn)學(xué)和進化等研究領(lǐng)域，DNA是最可靠的證據(jù)和研究過程的基本材料，被廣泛應(yīng)用。同時生命科學(xué)研究者日益認識到保存DNA對于今后系統(tǒng)生物醫(yī)學(xué)的發(fā)展的重要性，各國紛紛開始保存DNA。世界上最早開始實施大規(guī)模DNA保存的是冰島的Decode公司，全部DNA樣本及其相關(guān)資料來自于將近1/3的冰島成年人和90%以上的冰島老年人。利用其建立的生物樣本庫。Decode找到了心肌梗塞等20多種疾病的致病基因。隨后英國、美國、以色列等國家研究單位建立了類似的遺產(chǎn)資源樣本庫，并且以色列對外銷售這些資料齊全的人的DNA樣本。

基因組DNA的長期保存的主要挑戰(zhàn)來源于核酸酶的污染。核酸酶通過分解水解核苷酸之間的磷酸二酯鍵使DNA降解。傳統(tǒng)的DNA保存方法是使用無菌超純水或TE洗脫基因組DNA，于-20℃保存，由于TE溶液中含有EDTA，可以和金屬離子絡(luò)合后降低核酸酶的活性，以此來盡可能的降低污染核酸酶的活性，延長基因組DNA保存的時間。有文章報道為了盡可能的降低酶活，用高濃度的酒精-20℃保存，使用時離心除去酒精，或者利用更低溫度（-80度）保存。上述這些現(xiàn)有的在抽提完基因組DNA后保存在特定的溶液中的方法操作比較簡單直觀，但是并沒有從根本上杜絕核酸酶的消化作用，而僅僅是盡可能的降低其活性，保存的效果有好有差。特別是由于核酸酶活性較強，很難滅活，在保存溫度發(fā)生變化，DNA重復(fù)凍融的情況下，往往會出現(xiàn)較大范圍的DNA降解。

發(fā)明內(nèi)容

有鑒于此，本發(fā)明的目的在于針對目前方法無法從根源上杜絕核酸酶的影響，導(dǎo)致DNA長期保存過程中降解的問題，提供用于基因組DNA永久保存的接頭及方法。

為實現(xiàn)本發(fā)明的目的，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案：

用于基因組DNA永久保存的接頭，其特征在于，接頭序列兩端帶有硫代堿基修飾。

優(yōu)選的，所述接頭包括接頭1和接頭2，其中所述接頭1包括核苷酸序列如SEQ?ID?NO:1所示的DNA分子和核苷酸序列如SEQ?ID?NO:2所示的DNA分子，所述接頭2包括核苷酸序列如SEQ?ID?NO:3所示的DNA分子和核苷酸序列如SEQ?ID?NO:4所示的DNA分子。

本發(fā)明還提供了一種基因組DNA永久保存的方法，按照構(gòu)建DNA短片段文庫的方法，將用于基因組DNA永久保存的接頭與隨機打斷樣品基因組DNA片段連接后擴增保存。

優(yōu)選的，所述方法具體為隨機打斷樣品基因組DNA為一定長度的片段，在每個片段上分別連接序列兩端帶有硫代堿基修飾的接頭，利用與接頭組匹配的引物在高保真酶體系中擴增后低溫保存。

優(yōu)選的，所述在片段連接帶有硫代堿基修飾的接頭前還包括片段末端補平和加A的步驟。

優(yōu)選的，所述打斷為物理打斷或限制性內(nèi)切酶酶切。

優(yōu)選的，所述打斷后的樣品片段的長度為100bp-700bp。

優(yōu)選的，所述序列兩端帶有硫代堿基修飾的接頭包括接頭1和接頭2，其中所述接頭1包括核苷酸序列如SEQ?ID?NO:1所示的DNA分子和核苷酸序列如SEQ?ID?NO:2所示的DNA分子，所述接頭2包括核苷酸序列如SEQ?ID?NO:3所示的DNA分子和核苷酸序列如SEQ?ID?NO:4所示的DNA分子。

優(yōu)選的，所述引物為核苷酸序列如SEQ?ID?NO:5所示的DNA分子和核苷酸序列SEQ?ID?NO:6所示的DNA分子。

優(yōu)選的，所述高保真酶為Phusion超保真DNA聚合酶。

優(yōu)選的，所述低溫保存為于1×TE緩沖液中-20℃保存。