[發(fā)明專利]郁金香黃酮醇合成酶TfFLS蛋白及其編碼基因

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201310689297.2
• 申請(qǐng)日: 2013-12-16
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN103756982A
• 公開(kāi)（公告）日: 2014-04-30
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 袁媛;史益敏;唐東芹;馬曉紅;陶秀花
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 上海交通大學(xué)
• 主分類(lèi)號(hào): C12N9/06
• 分類(lèi)號(hào): C12N9/06;C12N15/53;C12N15/70
• 代理公司: 上海漢聲知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理有限公司 31236
• 代理人: 牛山;陳少凌

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于植物分子生物學(xué)領(lǐng)域，涉及郁金香類(lèi)黃酮合成途徑中關(guān)健酶及其編碼基因，具體涉及一種郁金香黃酮醇合成酶TfFLS蛋白及其編碼基因。?

背景技術(shù)

類(lèi)黃酮化合物是一類(lèi)多酚類(lèi)化合物，廣泛存在于自然界，根據(jù)對(duì)中心C環(huán)的不同修飾，可分為黃酮、異黃酮、黃烷酮、黃酮醇、黃烷醇和花青素等主要大類(lèi)，其中以黃酮醇類(lèi)化合物最為常見(jiàn)，占黃酮類(lèi)化合物總數(shù)的1/3左右。黃酮醇類(lèi)化合物廣泛地分布于多種植物中，它們是幾種與細(xì)胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)和細(xì)胞轉(zhuǎn)化有關(guān)激酶的抑制劑，具有多種生物活性，由于它們能夠有選擇地阻斷細(xì)胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)通路，因此黃酮類(lèi)化合物被認(rèn)為是治療腫瘤的潛在的化合物。黃酮醇合成酶(flavonol?synthase，F(xiàn)LS)是類(lèi)黃酮合成途徑中黃酮醇合成的直接調(diào)控酶，它催化黃酮結(jié)構(gòu)中的C3位羥基化，從而形成各種黃酮醇類(lèi)物質(zhì)，決定著黃酮醇的合成。因此FLS基因是研究黃酮代謝調(diào)控中的關(guān)鍵基因之一。?

類(lèi)黃酮同時(shí)為花色素的一大類(lèi)，它使花朵產(chǎn)生從黃到紫的全部顏色。黃酮醇一般為黃色或無(wú)色，能作為輔助色素影響花色。FLS基因的表達(dá)可直接影響植物的花色。在矮牽牛中，黃酮醇合成酶可通過(guò)影響共色素合成或底物競(jìng)爭(zhēng)方式，改變黃酮醇與花色苷的比例，從而改變花色(Mol?J等，1998)。藏報(bào)春(Primulasinensis?Sabine?ex?L.)黃酮醇產(chǎn)生受基因B控制，含有共色素的花色為紫色，缺少黃酮醇的花色為絳紫色(Forkman?G，1991)。矮牽牛中，增加黃酮醇合成酶基因的表達(dá)通常會(huì)使花顯藍(lán)色，反義表達(dá)FLS?eDNA則使花色明顯變淡(Holton?TA等，1993)。?

目前，人們已在矮牽牛(Petunia?hybrida)、馬鈴薯(Solanum?tuberosum)、蘋(píng)果(Malus?pumila)、蜜柑(citrus)、葡萄(Vitis?vinifera)、銀杏(Ginkgo?biloba)等植物中克隆了FLS基因，但郁金香(Tulipa?fosteriana)中黃酮醇合成酶基因的克隆及其表達(dá)模式尚不清楚。目前，未有任何與郁金香FLS蛋白及其編碼基因序列相關(guān)的文獻(xiàn)報(bào)道。?

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的在于提供一種郁金香黃酮醇合成酶TfFLS蛋白及其編碼基因。本發(fā)明公開(kāi)了郁金香TfFLS編碼基因在郁金香不同器官、不同發(fā)育階段的表達(dá)模式；本發(fā)明的郁金香TfFLS基因在大腸桿菌細(xì)胞中表達(dá)重組的黃酮醇合成酶蛋白，能使二氫山奈酚生成山奈酚。利用本發(fā)明的郁金香TfFLS基因，通過(guò)各種常規(guī)篩選方法，可篩選出與FLS發(fā)生相互用的物質(zhì)、受體、抑制劑或拮抗劑等。?

本發(fā)明的目的是通過(guò)以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的，?

第一方面，本發(fā)明涉及一種具有郁金香黃酮醇合成酶活性的蛋白質(zhì)，所述蛋白質(zhì)是由如SEQ?ID?NO.2所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)；或由SEQ?ID?NO.2所示的氨基酸序列經(jīng)過(guò)取代、缺失或者添加一個(gè)或幾個(gè)氨基酸且具有郁金香黃酮醇合成酶活性的由(a)衍生的蛋白質(zhì)。該蛋白質(zhì)在花朵花瓣的不同著色階段、不同器官內(nèi)的有無(wú)及活性大小存在較大差異。?

優(yōu)選的，所述蛋白質(zhì)為SEQ?ID?NO.2所示氨基酸序列經(jīng)過(guò)1～50個(gè)氨基酸的缺失、插入和/或取代，或者在C末端和/或N末端添加1～20個(gè)以內(nèi)氨基酸而得到的序列。?

進(jìn)一步優(yōu)選的，所述蛋白質(zhì)為SEQ?ID?NO.2所示氨基酸序列中1～10個(gè)氨基酸被性質(zhì)相似或相近的氨基酸所替換而形成的序列。?

第二方面，本發(fā)明涉及一種編碼上述蛋白質(zhì)的核酸序列。?

優(yōu)選的，所述核酸序列具體為：?

(a)堿基序列如SEQ?ID?NO.1第1～999位所示；?

或(b)與SEQ?ID?NO.1第1～999位所示的核酸有至少70％的同源性的序列；?

或(c)能與SEQ?ID?NO.1第1～999位所示的核酸進(jìn)行雜交的序列。?

優(yōu)選的，所述核酸序列具體為SEQ?ID?NO.1第1～999位所示的核酸序列中1～90個(gè)核苷酸的缺失、插入和/或取代，以及在5’和/或3’端添加60個(gè)以內(nèi)核苷酸形成的序列。?

第三方面，本發(fā)明涉及一種上述的核酸序列在制備重組黃酮醇合成酶中的用途。?

優(yōu)選的，所述制備包括如下步驟：構(gòu)建含所述核酸序列的原核表達(dá)載體，將所述原核表達(dá)載體轉(zhuǎn)化到大腸桿菌中，誘導(dǎo)培養(yǎng)，得到重組黃酮醇合成酶?