[發(fā)明專利]一種快速鑒定薔薇屬植物染色體數(shù)目的方法

無(wú)效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201310684352.9
• 申請(qǐng)日: 2013-12-13
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN103710439A
• 公開(kāi)（公告）日: 2014-04-09
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 趙梁軍;寇亞平;趙宏偉;高彬
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)
• 主分類號(hào): C12Q1/68
• 分類號(hào): C12Q1/68
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技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及鑒定植物尤其是薔薇屬植物的染色體數(shù)目的方法，屬于植物細(xì)胞生物學(xué)和細(xì)胞遺傳學(xué)領(lǐng)域。

技術(shù)背景

染色體是基因的載體，制備染色體標(biāo)本是細(xì)胞遺傳學(xué)的基礎(chǔ)，優(yōu)良的染色體制片技術(shù)，更是進(jìn)行染色體顯帶、組型分析、原位雜交等的先決條件。植物細(xì)胞染色體的觀察和分析，對(duì)于染色核型分析、減數(shù)分裂過(guò)程中染色體行為分析、細(xì)胞融合培養(yǎng)過(guò)程中染色體行為和細(xì)胞變異等遺傳現(xiàn)象的分析具有重要的意義。另外，基因工程育種在基因水平上產(chǎn)生的變異，也可以通過(guò)以染色壓片為基礎(chǔ)的染色體分帶、原位雜交、熒光原位雜交進(jìn)行基因定位。

鑒定植物的染色體數(shù)目是染色體分析的一種非常重要的分析，一般經(jīng)常采用生長(zhǎng)活躍的材料組織進(jìn)行。莖尖和根尖通常被認(rèn)為是生長(zhǎng)活躍的組織，是有絲分裂的高發(fā)區(qū)，因而成為染色體計(jì)數(shù)常用的材料。相對(duì)于根尖和莖尖而言，花芽很少作為染色體計(jì)數(shù)分析的材料，原因可能是花芽中存在的色素等物質(zhì)干擾，需要特殊的更加耗時(shí)耗力的前處理，而且取材時(shí)間受到更多的限制，如破壞植株的生長(zhǎng)狀態(tài)。

薔薇屬(Rosa)植物是世界著名的觀賞植物，包括薔薇、月季和玫瑰等，該屬有200多個(gè)種，廣泛分布于寒溫帶至亞熱帶地區(qū)。作為世界性的觀賞植物之一，薔薇屬植物的栽培品種有30000多個(gè)，遺傳背景非常復(fù)雜，染色體數(shù)目及倍性差異較大，目前已知有2，3，4，5，6，8和10倍體和非整倍體等，這是造成遠(yuǎn)緣雜交不親和與雜種高度不育的主要原因，也是人們通過(guò)雜交育種獲得優(yōu)良目標(biāo)性狀的主要障礙。因此，在雜交育種前很有必要對(duì)親本材料進(jìn)行染色體倍性鑒定。但是，由于薔薇屬植物為木本，且遺傳背景復(fù)雜性，染色體為中小型，導(dǎo)致染色體計(jì)數(shù)分析難度大，鑒定草本植物例如香石竹的染色體數(shù)目的方法無(wú)法有效地應(yīng)用于薔薇屬植物。另外，薔薇屬植物不易取到合適的材料、材料的組織細(xì)胞難以解離，造成染色體計(jì)數(shù)結(jié)果不準(zhǔn)確、不穩(wěn)定甚至無(wú)法計(jì)數(shù)，而且計(jì)數(shù)時(shí)間長(zhǎng)，不適合快速準(zhǔn)確地進(jìn)行大批量品種的染色體數(shù)目鑒定。

常用于的鑒定植物染色體的材料是根尖，但薔薇屬植物的種子萌發(fā)比較困難，且實(shí)生后代有變異，尤其是月季（Rosa?Hybrida）。另外薔薇屬很多種或品種扦插生根困難，扦插周期長(zhǎng)，費(fèi)時(shí)費(fèi)力，產(chǎn)生的不定根容易木質(zhì)化，不易把握取材時(shí)間,并且在做鏡檢時(shí)，顯微鏡視野中分裂相細(xì)胞少，染色體分散不良，難以進(jìn)行染色體計(jì)數(shù)。雖有人報(bào)道用薔薇屬植物的幼嫩莖尖做材料，但是由于莖尖生長(zhǎng)點(diǎn)的分裂相細(xì)胞數(shù)目有限，準(zhǔn)確取材困難，且存在著組織細(xì)胞不易解離以及細(xì)胞內(nèi)含物或分泌物干擾壓片效果等問(wèn)題。在香石竹上可用花蕾鑒定染色體數(shù)目，但尚未見(jiàn)到利用薔薇屬植物的花芽作為染色體計(jì)數(shù)分析的材料的報(bào)道。

盡管薔薇屬植物的染色體數(shù)目計(jì)數(shù)分析難度很大，但非常重要。尤其是需要開(kāi)發(fā)出準(zhǔn)確快速鑒定薔薇屬植物染色體的方法。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的是為了解決上述問(wèn)題中的一個(gè)或者全部問(wèn)題。為此，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案：

1.一種鑒定薔薇屬植物的染色體數(shù)目的方法，所述方法依次包括如下步驟：

（1）取材步驟：獲取來(lái)自薔薇屬植物的材料；

（2）預(yù)處理步驟：使用預(yù)處理液對(duì)所述材料進(jìn)行處理；

（3）固定步驟：使用固定液對(duì)所述材料進(jìn)行固定；

（4）解離步驟：使用解離溶液對(duì)所述材料進(jìn)行解離；

（5）染色步驟：使用染色溶液對(duì)所述材料進(jìn)行染色；

（6）壓片步驟：對(duì)所述材料進(jìn)行壓片；和

（7）鏡檢步驟：通過(guò)使用顯微鏡對(duì)所述材料進(jìn)行檢測(cè)來(lái)確定所述材料的細(xì)胞中的染色體的數(shù)目；

其中，在所述壓片步驟中，以28至34N的力對(duì)所述材料上的蓋玻片垂直敲擊160至200次。

2、如技術(shù)方案1所述的方法，其中，所述敲擊分為依次進(jìn)行的第一遍敲擊和第二遍敲擊，并且使用帶有橡皮末端的未削鉛筆進(jìn)行，所述第一遍敲擊以28N至34N的力垂直敲擊所述材料上的蓋玻片80-100次，所述第二遍敲擊以相同的力度和次數(shù)進(jìn)行垂直敲擊，并且所述第一遍敲擊使用所述鉛筆的橡皮末端進(jìn)行，所述第二遍敲擊采用所述鉛筆的另一末端進(jìn)行。

3、如技術(shù)方案1或2所述的方法，其中，所述壓片步驟通過(guò)如下方式進(jìn)行：將經(jīng)染色的所述材料放置在載玻片上，然后滴上45體積%的醋酸溶液，蓋上蓋玻片，用吸水材料吸走多余的溶液，蓋上一層濾紙，左手按住蓋玻片的一端，右手拿鉛筆依次進(jìn)行所述第一遍敲擊和所述第二遍敲擊，最后將蓋玻片壓平并去掉濾紙。