[發(fā)明專利]一種北冬蟲夏草的特異PCR鑒真方法

無效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201310665903.7
• 申請(qǐng)日: 2013-12-11
• 公開（公告）號(hào): CN103602754A
• 公開（公告）日: 2014-02-26
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 程池;扎西才吉;李輝;姚粟;劉洋;白飛榮
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 中國食品發(fā)酵工業(yè)研究院;玉樹藏族自治州三江源藥業(yè)有限公司
• 主分類號(hào): C12Q1/68
• 分類號(hào): C12Q1/68
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于新資源保健食品鑒真領(lǐng)域，具體涉及北冬蟲夏草的鑒真方法。

背景技術(shù)

北冬蟲夏草科學(xué)名為蛹蟲草（Cordyceps?militaris），是一味我國民間傳統(tǒng)的名貴中藥，其成分和功效與冬蟲夏草相似，既能加工成藥品保健品，又是餐桌上的佳肴，因此廣受消費(fèi)者喜愛。

作為冬蟲夏草替代品，北冬蟲夏草具有可人工栽培，產(chǎn)量高，成本低等優(yōu)點(diǎn)，已形成規(guī)模化生產(chǎn)。據(jù)統(tǒng)計(jì)，我國2012年北冬蟲夏草的生產(chǎn)量接近8000噸，市場規(guī)模達(dá)到近15億元。然而，目前尚沒有專門用于北冬蟲夏草真假鑒別和質(zhì)量控制的標(biāo)準(zhǔn)方法，產(chǎn)品質(zhì)量難以保證，極大限制了北冬蟲夏草產(chǎn)業(yè)的升級(jí)和規(guī)范發(fā)展。

因此，在北冬蟲夏草生產(chǎn)和流通過程中，亟需一種有效、快速、準(zhǔn)確的鑒真方法，以實(shí)現(xiàn)對(duì)其品質(zhì)的控制和管理。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的是提供一種可用于北冬蟲夏草鑒真的可靠方法。

為達(dá)到上述目的，本發(fā)明設(shè)計(jì)了北冬蟲夏草性持家基因的特異PCR引物，通過一次單管PCR反應(yīng)，擴(kuò)增北冬蟲夏草特征性持家基因，實(shí)際擴(kuò)增片斷為417bp。

用于北冬蟲夏草鑒真的引物序列如下：

上游引物CICC-?Cor?-F1：5’-?AGCGAAACCCGTCTATCACC?-3’

下游引物CICC-?Cor?-R1：5’-?CTTGGGGCCTTCTTCCGAAT?-3’。

本發(fā)明采用的技術(shù)方案如下：

1)????????獲取樣品基因組DNA；

2)????????采用上述引物在PCR儀上進(jìn)行PCR擴(kuò)增；

PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系為25μL，其中10×Taq?reaction?buffer?2.5μL，2條引物（10μmol/L）各1μL，10μmol/L?的dNTP?2μL，2.5U的Taq酶0.5μL，DNA模板1.0μL，ddH₂O?17μL。

PCR擴(kuò)增的反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性5min，進(jìn)入循環(huán)：95℃?30s，55℃退火30s，72℃延伸30s，共35個(gè)循環(huán)，然后72℃延伸5min。

3)????????PCR擴(kuò)增產(chǎn)物用2%的瓊脂糖凝膠進(jìn)行檢測(cè)。

4)????????樣品的真實(shí)性判斷

????在紫外燈下查看電泳條帶，在417bp處有明亮條帶的為北冬蟲夏草，無條帶者為偽品。

????本發(fā)明經(jīng)過充分的前期試驗(yàn)篩選和優(yōu)化，得到的引物特異性強(qiáng)，PCR擴(kuò)增條件簡單，采用一次單管特異PCR反應(yīng)后，通過電泳檢測(cè)便可鑒別產(chǎn)品真?zhèn)危僮骱唵危杀镜停瑴?zhǔn)確度高，具有很好的應(yīng)用前景。

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附圖說明

圖1為北冬蟲夏草RPB1基因特異性引物設(shè)計(jì)示意圖，其中有下劃線的部分為擴(kuò)增片段對(duì)應(yīng)的核苷酸序列，有下劃線的斜體部分為所設(shè)計(jì)的引物特異性結(jié)合位點(diǎn)。?

圖2為PCR擴(kuò)增產(chǎn)物在2%瓊脂糖凝膠中的電泳圖譜，1-DL2000?Marker，2-北冬蟲夏草，?3-冬蟲夏草菌粉，4-蝙蝠蛾擬青霉，5-亞香棒蟲草，6-陰性對(duì)照，7-?DL2000?Marker。

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具體實(shí)施案例

下面結(jié)合實(shí)施案例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行具體說明，實(shí)施案例是為了進(jìn)一步闡述本發(fā)明，而不會(huì)給本發(fā)明造成任何限制。

實(shí)施例一：?PCR引物的設(shè)計(jì)及其對(duì)樣品的檢測(cè)

1????????北冬蟲夏草RPB1基因特異PCR引物的設(shè)計(jì)

根據(jù)GenBank上公開登錄的北冬蟲夏草RPB1基因序列信息進(jìn)行引物設(shè)計(jì)（見附圖1）。

參考序列的GenBank登錄號(hào)為：JN992491。

在13-32處設(shè)計(jì)上游引物，命名為CICC-Cor-F1。序列為：5’-?AGCGAAAC?CCGTCTATCACC?-3’。

在410-429處設(shè)計(jì)下游引物，命名為CICC-Cor-R1。序列為：5’-?CTTGGGGC?CTTCTTCCGAAT?-3’。

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2????????樣品的檢測(cè)

2.1?樣品的收集

購買市售北冬蟲夏草、冬蟲夏草菌粉、蝙蝠蛾擬青霉菌粉、亞香棒蟲草。

2.2?樣品基因組DNA提取

采用改良CTAB法提取基因組DNA，并使用OMEGA公司生產(chǎn)的DNA純化試劑盒對(duì)其進(jìn)行純化。

2.3?基因組DNA的多重PCR擴(kuò)增