[發明專利]一種小麥籽粒硬度基因的SSR分子標記方法

有效

• 申請號: 201310655956.0
• 申請日: 2013-12-06
• 公開（公告）號: CN103757096A
• 公開（公告）日: 2014-04-30
• 發明（設計）人: 張懷剛;劉寶龍;李善福;劉登才;張波;陳文杰;沈裕虎;李建民;魏樂
• 申請（專利權）人: 中國科學院西北高原生物研究所
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68
• 代理公司: 北京方圓嘉禾知識產權代理有限公司 11385
• 代理人: 董芙蓉

技術領域：

本發明屬于小麥分子標記輔助育種技術領域，涉及一種小麥籽粒硬度基因的SSR分子標記方法。

背景技術：

籽粒硬度是國內外小麥市場分級和定價的重要依據。它能夠影響面粉顆粒度大小、出粉率、潤麥加水量、破損淀粉粒數量。硬度值小的小麥磨制的面粉顆粒度較小、破損淀粉含量低，吸水能力較弱，而硬度值大的小麥磨制的面粉顆粒度大、破損淀粉含量高，具有較強的吸水能力。這些特性的差異影響揉制面團特性，從而影響制作食品的類型。如軟質小麥適合于制作餅干和糕點等甜食類食品；硬質麥面粉適合制作面包和優質面條等食品。

小麥的籽粒硬度性狀主要由位于小麥5D染色體短臂上緊密連鎖的Puroindoine?a(Pina)和Puroindoine?b(Pinb)基因調節，兩個基因編碼區在染色體上的間距為17kb。Pina和Pinb基因都處于野生狀態時，籽粒表現為軟質；當Pina或Pinb基因任一基因缺失或突變時，籽粒表現為硬質；當缺乏D組染色體時，籽粒硬度最大，稱硬粒麥，又稱杜倫麥(Durum)。目前，已在普通小麥中發現大量Pina和Pinb基因的突變類型，除少部分為片段缺失以外，多為單堿基突變。如常見的硬質小麥類型Pinb-D1b，是Pinb基因中223位點的鳥嘌呤(G)突變為腺嘌呤(A)，導致該基因的氨基酸序列中第46位點的甘氨酸(Glycine，Gly)突變為絲氨酸(Serine，Ser)。

而目前SNP主要檢測方法有如下缺陷：一、以凝膠電泳為基礎的傳統檢測方法，如限制性片段長度多態性、變性梯度凝膠電泳、等位基因特異PCR等，檢測靈敏度低；二、核苷酸測序法，需要昂貴的3730測序儀，每個樣品的成本在10元左右；三、基因芯片，同樣需要昂貴的儀器，四、Taqman探針法，合成一條熒光引物的成本在300元左右。

發明內容：

針對上述問題，本發明要解決的技術問題是提供一種小麥籽粒硬度基因的SSR分子標記方法。

在NCBI數據庫中檢索到包含pina和pinb基因的BAC序列，該BAC庫包含187kb的核苷酸序列，通過SSRfinder軟件尋找到20個具有簡單重復的序列，根據SSR位點的重復序列的特征和pina和pinb基因的距離核苷酸長度設計了4對PCR引物。SSR5的正向引物為GTTCGGGAGGTACCATATTT，反向引物為AGTGGGGGTTAAGGAGTG；SSR7的正向引物為CAAGTTTAGTTTCGCAAAA，反向引物為TGTATGTGCAACTTTGTGAAG；SSR9的正向引物為TTCAGCTTAACCATTCCTACA，反向引物為CCTTCGAACCTAATGAAATCT；SSR15的正向引物為TCGTACAGAGGGAAGTTCAG，反向引物為GCAGATGGAGTCTACACACTT。SSR5和SSR7引物具有有效擴增，而SSR7具有明顯的多態性。在187個普通小麥品種中發現4種等位變異，測序后發現核苷酸長度分別為149bps，151bps，153bps，155bps。SSR7-1中AG重復17次，SSR7-2中AG重復18次，SSR7-3中AG重復19次，SSR7-4中AG重復20次，利用聚丙烯酰胺電泳可以清晰地將目標類型分開。對4中類型的不同品種的pina和pinb基因進行測序后發現，SSR7-3類型檢測到野生型，SSR7-4類型中檢測到Pinb-D1C突變，而SSR7-2類型檢測到Pinb-D1B，而SSR7-1檢測到Pinb-D1x。

本發明的有益效果為：SSR7所包含的由A和G兩個堿基組成的基本序列串聯重復組成的短片段，設計的SSR分子標記為共顯性標記，僅采用普通聚丙烯酰胺凝膠電泳即可完成，具有簡便、快速、穩定性高和等位基因多樣性高等優點。

具體實施方式：

本具體實施方式采用以下技術方案：它通過在與硬度基因緊密連鎖的一個具有SSR特征的核苷酸序列中設計包含該SSR的PCR引物，對目標品種進行PCR擴增后，通過聚丙烯酰胺電泳，可以對品種間Pina和Pinb基因的等位變異進行判定。

所述的核苷酸序列為：