[發(fā)明專利]一種低溫乙醇法提取玻璃酸酶粗品的方法

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201310647955.1
• 申請日: 2013-11-27
• 公開（公告）號: CN103667210A
• 公開（公告）日: 2014-03-26
• 發(fā)明（設計）人: 劉乃山;宋超龍;劉振海;劉翠珍
• 申請（專利權(quán)）人: 青島康原藥業(yè)有限公司
• 主分類號: C12N9/26
• 分類號: C12N9/26
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

技術(shù)領域

本發(fā)明涉及生物技術(shù)領域，具體地說涉及從新鮮動物睪丸中提取玻璃酸酶粗品的方法。

背景技術(shù)

玻璃酸酶又名透明質(zhì)酸酶，在哺乳動物的睪丸里含量很豐富，能水解透明質(zhì)酸，使其粘滯性明顯下降，有利于受精時精子進入卵子。也存在于精子、頜下腺、蜂毒、蛇毒、皮膚、脾臟、水蛭及細胞的溶酶體中。

玻璃酸酶的穩(wěn)定性較好，42℃加熱60分鐘活力不損失；100℃加熱5分鐘，活力可保留80％。受熱失活后進行冷卻可恢復部分活力。在pH5以下或pH8以上酶仍較穩(wěn)定。在低濃度水溶液中較易失活，但可加入0.2％或0.5％阿拉伯膠或0.2％明膠保護。Fe2+、Cu2+對酶有可逆抑制作用，Pb2+、Hg2+、Ni2+等對酶活性沒有明顯影響。硫酸軟骨素B(皮膚素)、硫酸類肝素、硫酸角質(zhì)素、肝素及高濃度玻璃酸酶對酶均有抑制作用，但可被0.15mol/L氯化鈉或硫酸魚精蛋白所逆轉(zhuǎn)。

藥用玻璃酸酶為白色或微黃色粉末，無氣味，易溶于水，不溶于丙酮、乙醚、乙醇等有機溶劑。生化制藥主要用牛、羊睪丸為原料進行提取制備。

低溫乙醇法是1940年由美國哈佛大學醫(yī)學院的Edwin?J.Cohn教授發(fā)明的，因此又稱為“孔氏法”。孔氏法最初用來分離牛血清白蛋白，隨后應用于人血漿分離。1944年，白蛋白制品首次進行臨床輸注，用于搶救7名在日軍偷襲珍珠港中嚴重燒傷的美國水兵，并由此開始了血漿蛋白制品的工業(yè)化生產(chǎn)。乙醇作為一種蛋白沉淀劑，具有許多優(yōu)點：介電常數(shù)低、與水易混溶、在正常環(huán)境和工作條件下無易爆性、低分子量、化學上的相對惰性、低毒、價廉、易得和抑菌作用。至今，大規(guī)模血漿蛋白分離仍基本采用低溫乙醇分離法。

王彥，周淑敏等曾在2002年15卷(1)期的《黑龍江醫(yī)藥》上發(fā)表了一篇名為《透明質(zhì)酸酶提取工藝的研究》的論文，較詳細的介紹了工業(yè)生產(chǎn)中從羊睪丸中提取玻璃酸酶的傳統(tǒng)工藝以及在此基礎上由他們改良的新工藝；李丹，郭育濤等曾在2011年8月第40卷第8期的《應用化工》上發(fā)表了一篇名為《牛睪丸中透明質(zhì)酸酶提取工藝研究》的論文，介紹了用鹽酸和乙酸的混合液溶解、硫酸銨鹽析方法，從牛睪丸中提取玻璃酸酶的實驗研究。國內(nèi)傳統(tǒng)工藝都是用酸液溶解和硫酸銨鹽析來提取玻璃酸酶粗品的，本專利采用酸液提取和低溫乙醇沉淀來提取玻璃酸酶粗品，在國內(nèi)尚屬首創(chuàng)，國內(nèi)相關論文、專利等文獻資料沒有低溫乙醇沉淀法制取玻璃酸酶粗品的相關介紹。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明提供了一種低溫乙醇法提取玻璃酸酶粗品的方法，采用酸液提取和低溫乙醇沉淀得玻璃酸酶粗品。具體步驟如下：

1提取：

將羊睪丸除內(nèi)外皮層及副睪丸，絞成糜漿。稱取糜漿，按每1kg糜漿加酸液1.0-1.5L的比例，加酸液攪拌，浸出4小時后，將浸出液過濾，濾液調(diào)pH3.2～4.0。

取濾渣，按每1kg開始加入的糜漿加酸液0.2-0.3L的比例，加酸液攪拌1小時后，再次過濾，濾液調(diào)pH3.2～4.0。

所述酸液為冰醋酸，鹽酸，氯化鈉和水的混合酸液。

2粗制：

合并兩次過濾液，在不斷攪拌下，加入預冷的無水乙醇，靜置2小時使其產(chǎn)生沉淀，將沉淀懸浮于0.15mol/L的氯化鈉溶液中，調(diào)pH形成沉淀，取上清液，將上清液調(diào)pH3.2-4.0，加入預冷的無水乙醇，靜置2小時，所得沉淀即為玻璃酸酶粗品。

粗制工序需在2-6℃冷庫中進行，兩次無水乙醇的添加量均為開始時合并的過濾液的50％。

與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的優(yōu)點和積極效果是：

國內(nèi)現(xiàn)有技術(shù)是用酸液溶解、硫酸銨鹽析的方法來制取玻璃酸酶粗品，而本發(fā)明技術(shù)是采用酸液提取和低溫乙醇沉淀來制取玻璃酸酶粗品，國內(nèi)相關論文、專利等文獻資料沒有低溫乙醇沉淀法制取玻璃酸酶粗品的相關介紹，本發(fā)明首次采用低溫乙醇沉淀來提取玻璃酸酶粗品，在國內(nèi)尚屬首創(chuàng)。生產(chǎn)工藝簡易、收率高，適合大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)。該項成果有良好的經(jīng)濟效益和社會效益，它不但解決國內(nèi)外醫(yī)療用藥的需求，還為養(yǎng)殖產(chǎn)品的綜合利用開拓了新路，對養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展有積極意義。

具體實施方式

下面結(jié)合具體實施例對本發(fā)明作進一步說明。

實施例1

1提取：

稱取糜漿5kg加酸液6.3L，攪拌浸出4小時后，將浸出液過濾，濾液調(diào)pH3.49。

取濾渣加酸液1.1L，攪拌1小時后，再次過濾，濾液調(diào)pH3.57。

2粗制：