[發明專利]紫花地丁鑒別的引物及PCR方法

無效

• 申請號: 201310642681.7
• 申請日: 2013-12-05
• 公開（公告）號: CN104212882A
• 公開（公告）日: 2014-12-17
• 發明（設計）人: 李旻輝;崔占虎;龍平
• 申請（專利權）人: 李旻輝;崔占虎;龍平
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;C12N15/11
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

技術領域

本發明屬于分子生物學技術領域，涉及蒙藥材及蒙成藥鑒定領域，特別涉及一種能夠特異鑒定紫花地丁的PCR擴增方法及其特異引物。?

背景技術

紫花地丁為堇菜科(Violaceae)植物紫花地丁Viola?philippica?Cav.ssp?munda?W.Beck的干燥全草，又名地丁草、獨行虎、紫地丁，系早春開花的多年生草本。其性寒，味微苦，有清熱解毒、涼血消腫的功效，用于癰腫疔瘡、乳癰腸癰、丹毒腫痛、毒蛇咬傷等癥。?

“地格達”來自印度梵語音譯，蒙語為苦的意思。作為蒙醫常用要藥之一，具有清熱解毒、涼血消腫、平息“協日”，愈傷之功效。根據文獻記載和我們的實際調查研究，內蒙古地區作為“地格達”類蒙藥使用的植物多達7科30余種，然而由于內蒙古自治區區域廣闊而藥用資源物種分布的區域性差異明顯，游牧生產過程中徒遷頻繁而就地利用藥用資源等諸多原因，在蒙藥材中，同一品種的名稱、基原、臨床功效與使用等方面因地、因人而異的現象極為普遍。紫花地丁作為“地格達”類藥材之一也不例外，同時還調查統計發現含“地格達”類的蒙成藥在《內蒙古自治區蒙成藥標準》中共有超過20個品種，《部頒標準(蒙藥分冊)》中共有大約20個品種。其中含有紫花地丁的有5余種。由于“地格達”類蒙藥基原植物極為復雜，不同科屬的植物在不同地區等同入藥，致使目前“地格達”類蒙藥在不同地區市場流通、醫療部門及制藥企業應用十分混亂。這些情況同時也反映出了對蒙成藥中使用的“地格達”類生藥進行品種鑒定的必要性和迫切性。因此，建立一種用于鑒別紫花地丁的方法非常重要。?

之前鑒別紫花地丁的方法，如光譜和生物鑒定法等。程存歸等采用HATR-FTIR的方法對紫花地丁中進行鑒定(程存歸，吳小華，王森清，等.應用HATR-FTIR排序法識別中藥材紫花地丁及其真偽鑒別，分析化學研究簡報，2004，32(11)：1529-1531)，但這種方法比較繁瑣，不利于推廣。近年來發展的以分子生物學為基礎的檢測方法如DNA?barcoding和位點特異性PCR等克服了藥材傳統?鑒別方法準確度不高、主觀性大等缺點。對紫花地丁的分子鑒別還尚未見報道，本發明通過特異性PCR的方法實現了紫花地丁的快速、準確鑒別。在本發明被公布之前，尚未有任何公開或報道過本專利申請中所提及的PCR方法及引物。?

發明內容

本發明的目的是提供一種紫花地丁的PCR引物及其鑒定方法，該PCR鑒定方法操作簡單、樣品量少，能快速、準確的將紫花地丁從成藥中鑒定出來，為紫花地丁鑒定提供了一種實用的技術。?

1、一種鑒定紫花地丁的特異引物F1、F2，其序列為：?

F1：5’-ATTGATTTTACTTTATTGATTTTAC-3’，?

F2：5’-TACATCCGCCCCGAA-3’。?

2、一種紫花地丁的PCR鑒定方法，其特征在于，包括下列步驟：?

a)從所述材料中提取到DNA樣品；?

b)用權利要求1所述的引物進行PCR反應，擴增反應體系包括：10×buffer緩沖液2μL，dNTP1.6μL，引物各0.5μL，EX?Taq酶0.2μL，DNA0.5μL，滅菌蒸餾水14.7μL。反應條件：解鏈溫度95℃，時間5min，30sec，退火溫度53℃，時間30s，復性溫度72℃，時間為1min40s，40個循環后72℃延伸，時間為7min；?

c)電泳所述擴增產物，如果存在分子量約為275bp的單一條帶，則確定所檢材料為紫花地丁。?

附圖說明

圖1：紫花地丁及蒙成藥PCR鑒別結果?

1.空白對照；2.紫花地丁(呼倫貝爾)；3.地格達-3湯(呼倫貝爾)；4.額日合木-8(呼倫貝爾)；5.估古日古木朝克敦(呼倫貝爾)；6.地格達-4湯(通遼)；M.DNA分子量標準：從上至下依次為2000bp、1000bp、750bp、500bp、250bp、100bp?

具體實施方式

1材料?

所用材料如表1所示，包括：?

表1樣品來源表?

2鑒別引物設計?