[發(fā)明專利]樹脂脫色用于比色法測定α-淀粉酶抑制劑活性的方法

無效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201310631048.8
• 申請日: 2013-11-29
• 公開（公告）號(hào): CN103630500A
• 公開（公告）日: 2014-03-12
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 龍盛京;許云青;姚丹媚
• 申請（專利權(quán)）人: 廣西醫(yī)科大學(xué)
• 主分類號(hào): G01N21/25
• 分類號(hào): G01N21/25
• 代理公司: 廣西南寧公平專利事務(wù)所有限責(zé)任公司 45104
• 代理人: 王素娥

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及測定α-淀粉酶抑制劑活性的方法，具體是樹脂脫色用于比色法測定α-淀粉酶抑制劑活性的方法。中草藥藥材提取液經(jīng)D101大孔樹脂脫色后，比色法測定脫色后流份對a-淀粉酶活性的抑制作用，以此作為中草藥體外篩選a-淀粉酶抑制劑的方法參考。

背景技術(shù)

α-淀粉酶抑制劑能有效抑制唾液和胰a-淀粉酶活性，阻礙食物中碳水化合物的分解和消化，減少葡萄糖產(chǎn)生和攝取。臨床上α-淀粉酶抑制劑可有效預(yù)防和治療糖尿病和高血脂癥，還可運(yùn)用于減肥保健藥物的開發(fā)。因此篩選和尋找有效、安全的α-淀粉酶抑制劑仍是藥物學(xué)家們關(guān)注的熱點(diǎn)之一。

目前對于α-淀粉酶抑制劑的篩選方法主要采取3,5-二硝基水楊酸法。3,5-二硝基水楊酸法通過可溶性淀粉在α-淀粉酶作用下水解產(chǎn)生還原性基團(tuán)，將3,5-二硝基水楊酸還原為硝基氨基水楊酸從而產(chǎn)生顏色的變化，在520nm處測定吸光度值。α-淀粉酶抑制劑可以使得α-淀粉酶活性降低從而有效抑制α-淀粉酶水解可溶性淀粉的活性，使得A_520nm值降低，以此計(jì)算出待測物對α-淀粉酶的抑制率。

由于該法是一種比色分析法，中草藥提取液的顏色會(huì)對測定結(jié)果產(chǎn)生干擾。已公開的文獻(xiàn)中，對于比色分析實(shí)驗(yàn)中顏色干擾的處理主要采取兩種方法。樣液顏色較淺時(shí)，直接采用背景顏色扣除法消除干擾；樣液顏色較深時(shí)，普遍采用活性炭對中草藥提取液脫色來消除干擾，但在實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，用活性碳脫色存在的問題：顏色較深的提取液需用較多的活性碳才能脫色，活性炭脫色會(huì)引起有效成分嚴(yán)重被吸附導(dǎo)致測定結(jié)果不準(zhǔn)確，如何采取一種有效方法脫去中草藥藥材提取液中的色素，減少顏色對比色分析的干擾，最大程度保證測定結(jié)果準(zhǔn)確性，這是需要解決的問題。中國專利申請201110414922.3使用強(qiáng)極性聚苯乙烯型共聚體大孔樹脂ADS-7聯(lián)合中性氧化鋁對三七總皂苷進(jìn)行脫色，專利申請?zhí)?00810153792.0以陰離子交換樹脂為脫色介質(zhì)對丹參水溶性提取物進(jìn)行脫色，這些都只是對提取物進(jìn)行脫色，并未見報(bào)道運(yùn)用于比色分析。專利申請?zhí)?00410014122.2運(yùn)用D101大孔樹脂只運(yùn)用于提高黃芪有效部位的提取率，D101大孔樹脂對中藥提取液脫色后運(yùn)用于比色分析的研究至今空缺。

發(fā)明內(nèi)容

鑒于比色法測定α-淀粉酶抑制劑的活性，現(xiàn)存在的顏色干擾問題，本發(fā)明的目的是提供樹脂脫色用于比色法測定α-淀粉酶抑制劑活性的方法。用D101大孔樹脂對中草藥藥材提取液進(jìn)行脫色，以達(dá)到即減少有效成分的損失，又能有效脫去提取物的色素，從而減少測定時(shí)色素帶來的干擾，提高比色法分析測定抑制劑對a-淀粉酶活性抑制的結(jié)果準(zhǔn)確性。

本發(fā)明解決上述技術(shù)問題的技術(shù)方案是：

1.樹脂脫色用于比色法測定α-淀粉酶抑制劑活性的方法，其特征在于，按以下步驟操作：

1）將提取液顏色較深的植物或藥材紅茶粉碎后用蒸餾水提取：

稱取紅茶粉末10.00g，加入100mL蒸餾水于90℃水浴中提取30min，過濾，藥渣加80mL蒸餾水于90℃水浴提取30min，過濾，藥渣加60mL蒸餾水于90℃水浴提取30min，過濾，將三次濾液合并，定容至250mL(濃度為每1ml相當(dāng)于0.04g生藥)。取30mL濾液離心，離心條件為（4000r/min）、10min。取上清液20mL作為上樣液。

2)準(zhǔn)確稱取經(jīng)常規(guī)處理、去除表面水分的D101大孔樹脂8.00g，將其裝入2cm*15cm層析柱中，柱體積約為13mL，取步驟1）的上樣液通過層析柱，控制流速為3BV/h。把流出液再重復(fù)一次通過層析柱，流出液分別用10%、30%、50%、70%、95%乙醇-水溶液梯度洗脫，流速2BV/h，每個(gè)梯度洗脫劑用量40mL(約為3BV)。收集各梯度洗脫流份。

3)各梯度洗脫流份，用3,5-二硝基水楊酸比色法測定脫色后流份對α-淀粉酶的抑制作用；

植物或藥材紅茶提取液的色素集中于30%～50%的乙醇梯度流份中，70%～95%流份色素較少，收集70%～95%流份用3,5-二硝基水楊酸比色法測定該流份對α-淀粉酶的抑制活性。

各梯度的洗脫流份在722分光光度計(jì)中平行測定A₅₂₀值6次，取平均值，以A₅₂₀值的大小來定量比較脫色的效果。

2.樹脂脫色用于比色法測定α-淀粉酶抑制劑活性的方法，其特征在于，按以下步驟操作：

1)將提取液顏色較深的植物或藥材夏枯草粉碎后用去離子提取：