[發明專利]一種直接發酵法生產L-蘋果酸的方法

有效

• 申請號: 201310630635.5
• 申請日: 2013-12-02
• 公開（公告）號: CN103627738A
• 公開（公告）日: 2014-03-12
• 發明（設計）人: 李德衡;嚴紀文;李樹標;劉建陽;張文麗;賈召鵬;魯守斌
• 申請（專利權）人: 山東阜豐發酵有限公司
• 主分類號: C12P7/46
• 分類號: C12P7/46;C12R1/67;C12R1/69
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

技術領域??本發明屬于微生物發酵技術領域，具體涉及一種直接發酵法生產L-蘋果酸的方法。

背景技術

蘋果酸,又名羥基丁二酸、羥基琥珀酸或1-羥基乙烷二羧酸,分子式為C₄H₆O₅，分子量134.09，結構式為HOOCCHOHCH₂COOH。蘋果酸具有右旋（D-型）和左旋（L-型）兩種旋光異構體及DL-型外消旋體三種型式產品。其中L-蘋果酸，廣泛存在于生物體中，作為三羧酸循環的一員參與細胞代謝；D-蘋果酸人體不易代謝，吸入或吞咽其對人體有害，作為手性合成的手性源，可以合成許多重要的有機化合物；等量L-蘋果酸和D-蘋果酸的混合物為外消旋DL-蘋果酸，在化學工業方面用途廣泛。

L-蘋果酸是天然果酸的重要組成部分，廣泛存在于自然界蔬菜和其它水果中，其呈味作用明顯，酸味持久柔和、風味別致、解渴爽口、性質穩定，是優良的酸味劑和調酸劑，是國際公認的安全、無毒無害的食用有機酸。此外，它還具有重要的生理功能，可食藥兩用，對加強機體健康有所裨益。例如，我國是肝炎高感染、高發病國家，據統計，人群感染各類肝炎病毒者達10%左右，目前對肝炎的治療尚無特效藥。發揮蘋果酸護肝作用，將其與民間治療肝病的草藥配伍，開發成護肝產品，作為肝病患者及健康人的日常保健食品，可以加強人體新陳代謝，提高免疫力。總之蘋果酸的應用領域十分廣闊。

近年來,?L-蘋果酸市場逐漸啟動,?國際市場對蘋果酸的需求量快速增加，已呈現嚴重供不應求的局面，需求量一直以年均10%左右的高速度增長和保持。由于用天然產物提取或者化學合成工藝生產蘋果酸的方法成本過高,?,因此用微生物的方法合成L-蘋果酸是今后大規模生產的趨勢。

利用微生物發酵法生產L-蘋果酸，目前主要有三種方法，一種是直接發酵法，一般采用糖類為原料，用霉菌直接發酵生產L-蘋果酸；一種是兩步發酵法，即先用根霉菌將糖類發酵成富馬酸，在由酵母將底物富馬酸轉化成L-蘋果酸的工藝；另一種是酶轉化法，即用微生物生產的延胡索酸酶將底物富馬酸轉化為L-蘋果酸。以糖質為原料發酵蘋果酸工藝中,一步發酵法和混合發酵法都有較大進展,但有關的研究報道尚少。本發明以霉菌為出發菌株,葡萄糖為主要生產原料,通過搖床培養考察葡萄糖生產L-蘋果酸的發酵條件,通過對發酵溫度、培養基初始pH、轉速和接種量等參數的優化,其產酸水平最高可達150.3g/L。

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發明內容

本發明提供了一種直接發酵法生產L-蘋果酸的方法,本專利以霉菌為出發菌株,葡萄糖為主要生產原料,通過搖床培養考察糖蜜生產L-蘋果酸的發酵條件,?通過對碳酸鈣濃度、氮源的選擇、發酵溫度和轉速的優化，克服了現有技術的不足，進行了多次探索和試驗，獲得一種生產蘋果酸的方法。

本發明的技術方案是通過如下方式來實施的：

一種直接發酵法生產L-蘋果酸的方法，其包括如下步驟：

將霉菌混合菌液(米曲霉(Aspergillus?oryzae)和黃曲霉(Aspergillus?flavus)兩種菌液體積比為3∶1，兩種菌液中菌體的濃度均約為1×10⁸CFU/mL)按照10％(體積比)的接種量接入種子罐中進行培養，在溫度為34℃，搖床轉速為180r/min，培養16小時得到液體A，其中，種子罐的培養基組分為：蔗糖3g，NaNO_3??0.2g，(NH₄)₂SO_4??0.5g，FeSO₄·7H₂O?0.01g，MnSO₄·H₂O?0.02g?，MgSO₄?0.02g，KH₂PO_4?0.1g，pH值6.0。然后按照液體A∶發酵罐培養基為1∶10的體積比例轉入發酵罐中培養，溫度34℃，培養6d，所述發酵罐培養基組分為：葡萄糖80g/L，加玉米漿10g/L，碳酸鈣75g/L，KH₂PO_4?0.1g/L，K₂HPO_4?0.1g/L，?(NH₄)₂SO_4?2g/L，MgSO₄?2?g/L，NaCl?0.2g/L，pH值6.0；