[發明專利]螺桿菌的體外培養

無效

• 申請號: 201310629918.8
• 申請日: 2007-11-14
• 公開（公告）號: CN103667127A
• 公開（公告）日: 2014-03-26
• 發明（設計）人: M·巴埃萊;F·黑斯布魯克
• 申請（專利權）人: 根特大學
• 主分類號: C12N1/20
• 分類號: C12N1/20;A61K39/02;A61P31/04;C12R1/01
• 代理公司: 上海專利商標事務所有限公司 31100
• 代理人: 陶家蓉

本申請是2007.11.14提交的200780041991.6，題為“螺桿菌的體外培養”的分案申請。

發明領域

本發明涉及用于體外分離和/或培養螺桿菌、尤其是“暫定豬螺桿菌(Candidatus?Helicobacter?suis)”的方法和工具。本發明還涉及由分離的螺桿菌培養物制備抗原和疫苗。

發明背景

人群中的幽門螺桿菌(Helicobacter?pylori)感染是胃和十二指腸潰瘍以及胃癌的一個主要原因。幽門螺桿菌(H.pylori)不是唯一一種能在人的胃黏膜上集落化的螺桿菌。已經在約0.96%的人的胃活組織切片中發現了“海爾曼螺桿菌”(Helicobacter?heilmannii，建議名)(Heilmann和Borchard(1991)Gut32，137–140)。這一生物體與胃炎密切相關，但也與消化器官潰瘍、胃腺癌以及黏膜相關淋巴組織淋巴瘤相關。近期的證據顯示，海爾曼螺桿菌(H.heilmannii)不是單一的物種，而是代表了具有相似的螺旋形形態的不同細菌種類，其中大部分可能具有人畜共患性起源。在16S?rRNA基因序列的基礎上分為1型海爾曼螺桿菌和2型海爾曼螺桿菌(Solnick等，(1993)J.Infect.Dis.168，379-385)。50%以上的人類海爾曼螺桿菌感染是由1型海爾曼螺桿菌引起的(Trebesius等，(2001)J.Clin.Microbiol.39，1510-1516)。1型海爾曼螺桿菌已被證實等同于“暫定豬螺桿菌”(Candidatus?H.suis)(O’Rourke等，(2004)Int.J.Syst.Evol.Microbiol.54，2203-2211)，后者是一種在60%以上屠宰的豬的胃中集落化的迄今無法培養的螺旋形細菌。暫定豬螺桿菌在豬的胃病中的實際作用仍不清楚，但已經指出，這一細菌與食管部()胃潰瘍以及慢性幽門胃炎相關。使用小鼠接種將這一細菌從受感染的豬胃黏膜中分離出來(Dick等，(1989)J.Med.Microbiol.29，55-62)。Hellemans等人[(2005)Antimicrob.agents?chemother.49，4530–4535]改進了現有的暫定豬螺桿菌感染的體內小鼠模型，用于評價這一生物體的抗生素易感性。仍未實現暫定豬螺桿菌的體外培養。

發明概述

本發明是建立在開發能夠分離和培養螺桿菌、尤其是暫定豬螺桿菌()的培養體系的基礎上的，暫定豬螺桿菌在這之前未被證明能以體外分離株的形式培養。

本發明的第一個方面涉及一種用于分離螺桿菌的培養體系的應用，更具體地說，涉及一種包含固體成分的培養體系(即固體培養基)的應用，所述固體培養基包含至少7.5%血液或10%血清，其pH調節至5.0至6.0之間。

在一具體實施方式中，所述固體成分包含用于苛求生物體生長的營養素。更具體地說，這些營養素選自布氏、馬-欣二氏或心腦浸液培養基。

在進一步的具體實施方式中，存在于所述固體成分中的血清是濃度至少12.5%的血清。在另一具體實施方式中，存在于所述固體成分中的血液濃度至少為10%。

更具體地說，本發明涉及在“暫定豬螺桿菌”的分離中使用上述培養體系。

在第二個方面，本發明提供了用于從含有相同螺桿菌的樣品中分離螺桿菌、尤其是暫定豬螺桿菌的方法，所述方法包括在含有pH5.0到6.0之間、補充了至少10%血清或至少7.0%血液的培養基的培養體系中培養所述含螺桿菌的樣品的步驟。

在這些方法的具體實施方式中，所使用的培養基包含用于苛求菌生長的營養素。更具體地說，所述用于苛求菌生長的營養素選自布氏、馬-欣二氏或心腦浸液營養素。此外或或者，在具體實施方式中，所述培養基包含至少一種抑制不同于所培養的螺桿菌的真菌和/或革蘭氏陽性和/或革蘭氏陰性微生物生長的選擇性物質。在進一步的具體實施方式中，所述至少一種選擇性物質選自下組：萬古霉素、乳酸甲氧芐啶、多粘菌素B、頭孢磺啶、黏菌素、兩性霉素B、結晶紫、制霉菌素和乳鏈菌肽。

在本發明所述方法的具體實施方式中，含至少10%血清的所述培養基含有12.5和25%之間的血清。另外，含至少7.0%血液的所述培養基含有7.5和15%、尤其是10和15%之間的血液。

可選地，本發明所述方法中使用的培養基進一步包含從維生素B12、L-谷氨酰胺、腺嘌呤、鳥嘌呤、對氨基苯甲酸、L-胱氨酸、NAD(輔酶1)、輔羧酶、硝酸鐵、硫胺和鹽酸半胱氨酸中選擇的一種或多種生長因子。