[發(fā)明專利]檢測(cè)豬瘟病毒的RT-LAMP核酸試紙條試劑盒及應(yīng)用

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201310629121.8
• 申請(qǐng)日: 2013-11-29
• 公開（公告）號(hào): CN103602761A
• 公開（公告）日: 2014-02-26
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 陳金頂;鄧潔汝;勾紅潮;裴晶晶;劉翠翠;姚俊庸;趙明秋
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 華南農(nóng)業(yè)大學(xué)
• 主分類號(hào): C12Q1/70
• 分類號(hào): C12Q1/70;C12Q1/68;C12R1/93
• 代理公司: 廣州市華學(xué)知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理有限公司 44245
• 代理人: 蘇運(yùn)貞;楊曉松

1.一種檢測(cè)豬瘟病毒的RT-LAMP核酸試紙條試劑盒，其特征在于包含如下引物組和核酸檢測(cè)試紙條：

所述的引物組的核苷酸序列如下所示：

F3：5’-GGAAAGGGCAAAGAGGCA-3’；

B3:5’-CGAGAGCCCTTTCTGTGATC-3’；

FIP:5’-CCTCGCAGAAGGCGTAAACCAT-GTGGACAACCTGACACAAGC-3’；

BIP:5’-ACGGGAGTACCCTACAAGAGCT-AACCATCATCCCCGCACA-3’；

LoopB：5’-FITC-GACAGGGTGGCAAAAATTCATG-3’；

Probe：5’-CCACGGGAGTACCCTACAAGAG-Biotin-3’。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的檢測(cè)豬瘟病毒的RT-LAMP核酸試紙條試劑盒，其特征在于：所述的核酸檢測(cè)試紙條為通用型核酸檢測(cè)試紙條。

3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的檢測(cè)豬瘟病毒的RT-LAMP核酸試紙條試劑盒，其特征在于：包含全封閉式靶核酸擴(kuò)增物快速檢測(cè)裝置和權(quán)利要求1所述的引物組；全封閉式靶核酸擴(kuò)增物快速檢測(cè)裝置為將通用型核酸檢測(cè)試紙條置入一個(gè)掌上塑料檢測(cè)裝置內(nèi)得到。

4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的檢測(cè)豬瘟病毒的RT-LAMP核酸試紙條試劑盒，其特征在于：還包含dNTP混合物溶液、MgSO₄溶液、反應(yīng)緩沖液、鏈置換DNA聚合酶、甜菜堿溶液和AMV逆轉(zhuǎn)錄酶。

5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的檢測(cè)豬瘟病毒的RT-LAMP核酸試紙條試劑盒，其特征在于：包含濃度為5U/μL的AMV逆轉(zhuǎn)錄酶、10倍反應(yīng)緩沖液、濃度為8U/L的鏈置換DNA聚合酶、濃度為2.5mmol/L的dNTP混合物溶液、濃度為10mol/L的甜菜堿溶液、濃度為100mmol/L的MgSO₄溶液、濃度為10μmol/L的引物FIP、濃度為10μmol/L的引物BIP、濃度為10μmol/L的引物F3、濃度為10μmol/L的引物B3、濃度為10μmol/L的探針和濃度為10μmol/L的引物L(fēng)oopB。

6.權(quán)利要求1～5任一項(xiàng)所述的檢測(cè)豬瘟病毒的RT-LAMP核酸試紙條試劑盒的應(yīng)用，其特征在于包含以下步驟：

（1）配制RT-LAMP反應(yīng)體系，按終濃度計(jì)算，AMV逆轉(zhuǎn)錄酶為10⁵U/L、10倍反應(yīng)緩沖液為1倍、鏈置換DNA聚合酶為0.32U/L、dNTP混合物為0.4～0.6mmol/L、甜菜堿為1～2mol/L、MgSO₄為0～3mmol/L、FIP引物為1.6μmol/L、BIP引物為1.6μmol/L、F3引物為0.2μmol/L、B3引物為0.2μmol/L、探針Probe為1.2μmol/L、LoopB引物為1.2μmol/L，待測(cè)樣品RNA為12ng/μL；恒溫反應(yīng)；

（2）反應(yīng)：將步驟（1）恒溫反應(yīng)后的產(chǎn)物用核酸檢測(cè)試紙條檢測(cè)，10min觀察結(jié)果；

（3）結(jié)果判讀：直接肉眼判讀

①陰性：僅在質(zhì)控區(qū)出現(xiàn)一條紅色條帶，在檢測(cè)區(qū)內(nèi)無(wú)紅色條帶出現(xiàn)，證明所檢測(cè)的樣本沒(méi)有豬瘟病毒感染；

②陽(yáng)性：出現(xiàn)兩條紅色條帶，一條位于檢測(cè)區(qū)內(nèi)，另一條位于質(zhì)控區(qū)內(nèi)，證明所檢測(cè)的樣本為豬瘟病毒感染；

③無(wú)效：質(zhì)控區(qū)和檢測(cè)區(qū)內(nèi)均無(wú)紅色條帶出現(xiàn)，表明核酸試紙條失效。

7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的檢測(cè)豬瘟病毒的RT-LAMP核酸試紙條試劑盒的應(yīng)用，其特征在于：

步驟（1）中所述的dNTP混合物的終濃度為0.5mmol/L；

步驟（1）中所述的甜菜堿的終濃度為1.5mol/L；

步驟（1）中所述的MgSO₄的終濃度為3mmol/L；

步驟（2）中所述的恒溫反應(yīng)的時(shí)間為30～60min。

8.根據(jù)權(quán)利要求6所述的檢測(cè)豬瘟病毒的RT-LAMP核酸試紙條試劑盒的應(yīng)用，其特征在于：

步驟（2）中所述的恒溫反應(yīng)的條件為60℃反應(yīng)50min。