[發明專利]一種水母溶血毒素粗提物的制備方法

有效

• 申請號: 201310628068.X
• 申請日: 2013-11-29
• 公開（公告）號: CN103626861A
• 公開（公告）日: 2014-03-12
• 發明（設計）人: 張黎明;鄭杰民;常銀龍;王濤;尹慢慢;柳國艷;王倩倩;周永紅
• 申請（專利權）人: 中國人民解放軍第二軍醫大學
• 主分類號: C07K14/435
• 分類號: C07K14/435;C07K1/34
• 代理公司: 上海元一成知識產權代理事務所(普通合伙) 31268
• 代理人: 趙青

技術領域

本發明涉及海洋生物技術領域，具體涉及一種水母溶血毒素粗提物的制備方法。?

背景技術

水母毒素是一類毒性強烈的肽類毒素，具有心血管、溶血、神經、肝臟、皮膚與肌肉、蛋白酶等多重生物活性，是導致水母蜇傷系列癥狀的主要原因。?

溶血毒素是水母毒素的重要組分，是研究報道最多的一類水母毒素，其豐度較高，在水母捕食、防御過程中發揮重要作用，具有較高的研究價值。?

由于水母毒素具有熱不穩定、易粘附等特點，加之用于分離純化的毒素粗提物制備方法的局限性，水母溶血毒素成分的純化和鑒定工作進展較慢，總體上滯后于其他常見有毒生物溶血毒素。?

水母毒素粗提物制備主要有兩種方法：一種是以水母口腕部組織（觸手、口腕的混合物）為原料，利用水母組織易自溶的特點，低溫（4℃）下攪拌自溶3-4天，離心收集上清經透析即為毒素粗提物（Xiao?L,He?Q,Guo?Y,et?al.,Cyanea?capillata?tentacle-only?extract?as?a?potential?alternative?of?nematocyst?venom:Its?cardiovascular?toxicity?and?tolerance?to?isolation?and?purification?procedures[J].Toxicon.2009,53(1):146–152）；另一種是切取水母觸手、口腕或整個口腕部組織，低溫自溶3-4天后，離心收集沉淀，洗滌沉淀并收集其中的刺絲囊，再通過超聲或研磨破碎刺絲囊，離心收集上清經透析后為毒素粗提物樣品（Marino?A,Crupi?R,Rizzo?G,Morabito?R,Musci?G,La?Spada?G.2007.The?unusual?toxicity?and?stability?properties?of?crude?venom?from?isolatednematocysts?of?Pelagia?noctiluca(Cnidaria,Scyphozoa).Cell?Mol?Biol(Noisy-le-grand).53Suppl:OL994-1002.）。?

綜上所述，這兩種方法均需經過組織自溶，耗時較長。前者操作相對簡易，但必然引入大量非毒素類組織蛋白；后者所制毒素粗提物較前者純凈，但操作環節較多，期間刺絲囊發射率高、損耗大，所獲毒素蛋白量很小。總的來說，這兩種制備水母毒素粗提物的方法均存在局限性，難以滿足后續毒?素組分離純化的需要。?

發明內容

本發明的目的在于提供一種操作簡便、耗時較短、雜質較少且活性更強的水母溶血毒素粗提物的制備方法。?

本發明的主要技術方案是：以鮮活水母口腕（不含觸手）為原料，利用物理刺激方法，通過短時劇烈振蕩來激發刺絲囊，使得多數刺絲囊集中發射，排出囊中毒液，然后離心收集上清，粗提水母溶血毒素的方法。?

本發明提供了一種水母溶血毒素粗提物的制備方法，包括以下步驟：A、以鮮活水母不含觸手的口腕組織為原料，加入PBS（Phosphate?Buffer?Solution，磷酸鹽緩沖液）清洗；?

B、振蕩：加入與步驟A的口腕組織等體積的PBS，在渦旋振蕩器上以轉速2000-3200rpm，最優為3200rpm，振蕩1-5min，最優為2min；?

C、過濾：步驟B得到的內容物以100-500目，最優為300目篩網過濾，收集濾液；?

D、透析：步驟C得到的濾液置于截留分子量為1000Da透析袋中，4℃下用預冷的PBS透析6-24h，最優為8h，然后4℃下3000-10000×g離心10-30min，最優為10000×g離心10min，收集上清液，即得水母溶血毒素粗提物。?

所述的步驟A中，挑選有活力、口腕發達的水母個體，以尼龍絲手抄網捕撈，捕撈的鮮活水母置于盛有海水的容器中，直至其恢復自然活動形態；分離不含觸手的口腕組織，剪取口腕組織，分裝到離心管中。?

所述的步驟A中，加入與口腕組織等體積的PBS，搖動離心管，將上層清洗液傾盡。?

上述步驟中，PBS緩沖液是指磷酸鹽緩沖液（Phosphate?Buffer?Solution）。?

上述步驟中，預冷的PBS緩沖液中的預冷為常規技術，最優的為：使用的PBS緩沖液需經過孔徑為0.20μm的微孔濾膜過濾，于4℃預冷。?

本發明的方法操作簡便、耗時較現有技術縮短2-3天，非毒素類雜質蛋白引入少且不含心血管活性，而溶血活性更強，有利于溶血組分的進一步純化。?