[發明專利]一種結合熒光定量PCR技術的焦磷酸測序方法

在審

• 申請號: 201310627109.3
• 申請日: 2013-11-28
• 公開（公告）號: CN103602748A
• 公開（公告）日: 2014-02-26
• 發明（設計）人: 王彤;趙洪斌;陳大方
• 申請（專利權）人: 瑞希基因科技（北京）股份有限公司
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68
• 代理公司: 北京輕創知識產權代理有限公司 11212
• 代理人: 陳月福

技術領域

本發明涉及一種結合熒光定量PCR技術的焦磷酸測序方法，屬于生物技術領域。

背景技術

測序技術是序列分析和突變位點檢測的“金標準”，通過測序可直觀的得到靶標的核酸序列，為遺傳性疾病相關位點發現、耐藥位點分析等提供便利。核酸序列也是病原微生物分型的基礎，乙型肝炎病毒（HBV）、丙型肝炎病毒（HCV）等病原微生物的亞型區分都是基于病毒的全基因組序列差異或部分區域的序列差異。

近年來，已有一些測序產品和解決方案用于臨床診斷領域，包括病毒亞型分析、用藥位點篩查、遺傳疾病監測等。與傳統的Sanger測序技術相比，焦磷酸測序技術更適合在臨床大規模運用。主要在于：

（1）焦磷酸測序整個流程步驟少，操作簡便，且為實時檢測，即測序和檢測是同步進行，免去測序產物純化步驟，因此耗時少，檢測過程僅需10分鐘左右，對于一個檢測項目而言，從樣本處理至獲得測序結果，只需要6小時左右，基本當天即可出報告，非常適合臨床使用，而傳統的Sanger測序需要1.5-2個工作日左右；

（2）焦磷酸測序的靈敏度可至5%，若結合一些突變富集技術，可至1%甚至更低，而傳統的Sanger測序的靈敏度只有15-20%左右；

（3）焦磷酸測序可進行定量，即給出雜合子中不同基因型的比例，而傳統的Sanger測序不能做到這點；

（4）焦磷酸測序結果為軟件自動判斷，而傳統的Sanger測序需人工分析突變位點。

但無論傳統的Sanger測序還是優勢更為明顯的焦磷酸測序，都是基于普通PCR，對于臨床檢測，還存在一定的弊端，這些弊端包括：

（1）耗時長：PCR-電泳檢測PCR產物，一般需要2-3個小時；

（2）易污染：電泳、PCR產物純化（一般為切膠回收）等過程，均耗時長，易產生大量PCR產物氣溶膠，引起假陽性；

（3）易漏檢：電泳檢測靈敏度低，易造成漏檢；

（4）易損失：PCR產物純化過程中將損失一部分，影響低濃度模板的檢測效果；

（5）難定量：PCR產物的量通過電泳只能粗略估計，產物過多將使測序引物過快消耗，影響檢測效果，與此同時，臨床上有些項目是有定量要求的，如乙型肝炎病毒定量檢測。

發明內容

本發明所要解決的技術問題是提供一種結合熒光定量PCR技術的焦磷酸測序方法，本發明一方面克服了焦磷酸測序的現有弊端，提供一種適于臨床診斷領域的焦磷酸測序使用方法，另一方面提供基于上述方法在制備基因檢測試劑盒中的應用。

本發明解決上述技術問題的技術方案如下：一種結合熒光定量PCR技術的焦磷酸測序方法，包括：

1）熒光定量PCR：使用特異性的引物和帶熒光標記的探針，對靶標所在核酸片段進行擴增，并通過實時熒光定量PCR儀予以實時檢測，最后獲得靶標的定量結果和PCR產物；

2）制備PCR產物單鏈模板：將PCR產物固定于鏈霉親和素瓊脂糖HP珠子上，并制備成單鏈狀態；

3）測序反應及檢測：使用特異性的測序引物，在預先設置好的焦磷酸測序儀上，對PCR產物的單鏈模板進行測序反應，并實時檢測測序結果。

本發明還提供了一種基于上述方法的核酸檢測試劑盒，所述核酸檢測試劑盒包括：

1）用于熒光定量PCR的各種反應試劑，例如：目的片段特異性的PCR引物、目的片段特異性的熒光探針、DNA聚合酶；

2）用于固定并制備PCR產物單鏈模板的試劑；

3）用于測序反應的試劑，例如：目的片段特異性的測序引物。

在上述技術方案的基礎上，本發明還可以做如下改進。

進一步，所述核酸檢測試劑盒還包括：PCR反應液、測序反應液、陰性質控品、陽性質控品、定量標準品、尿嘧啶-N-糖基化酶（UNG酶）、dUTP。

由于采用了上述的技術方案，本發明提供的一種結合熒光定量PCR的焦磷酸測序方法，克服了普通PCR的弊端：

（1）熒光定量PCR反應時間較普通PCR結合電泳檢測的模式，縮短1-2個小時；

（2）無電泳、切膠純化等操作，最大限度減少了PCR產物氣溶膠，降低了假陽性風險；

（3）熒光定量PCR的靈敏度高，一些電泳檢測沒有條帶或條帶模糊PCR產物，也能進行焦磷酸測序，降低了漏檢率；

（4）無切膠純化等操作，避免PCR產物的大量損失；

（5）通過熒光值判斷PCR產物的量，較電泳圖確認準確度更高，進而提高測序峰圖的質量。