[發(fā)明專利]一種血管緊張素完全抗原的制備方法

無效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201310608983.2
• 申請日: 2013-11-25
• 公開（公告）號: CN103613660A
• 公開（公告）日: 2014-03-05
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 張振斌;張影;董婷婷;李克錦;劉萍;欒大偉
• 申請（專利權(quán)）人: 博奧賽斯（天津）生物科技有限公司
• 主分類號: C07K14/765
• 分類號: C07K14/765;C07K14/77;C07K14/47;C07K14/795
• 代理公司: 天津濱?？凭曋R產(chǎn)權(quán)代理有限公司 12211
• 代理人: 李莉華

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于免疫學(xué)技術(shù)領(lǐng)域，具體的是一種血管緊張素完全抗原的制備方法。

背景技術(shù)

血管緊張素(Angiotensin)，亦稱血管收縮素、血管張力素，是一種寡肽類激素，是腎素-血管緊張素系統(tǒng)(renin-angiotensin?system)的重要組成部分。血管緊張素能引起血管收縮，升高血壓；促進(jìn)腎上腺皮質(zhì)釋放醛固酮(Aldosterone)。它也具有很強的致渴作用。血管緊張素Ⅰ能刺激腎上腺髓質(zhì)分泌腎上腺素，它直接收縮血管的作用不明顯；血管緊張素Ⅱ能使全身小動脈收縮而升高血壓，此外，還可促進(jìn)腎上腺皮質(zhì)分泌醛固酮，醛固酮作用于腎小管，起保鈉、保水、排鉀作用，從而引起血量增多，血壓升高；血管緊張素Ⅲ的縮血管作用較弱，只有血管緊張素Ⅱ的1/5，但促進(jìn)醛固酮分泌的作用卻強于血管緊張素Ⅱ。

檢測血漿中腎素活性（PRA，即血管緊張素Ⅰ4℃/37℃血漿濃度）、血管緊張素Ⅱ（AⅡ）和醛固酮（ALD）已成為原發(fā)性和繼發(fā)性高血壓分型診斷、治療及研究的重要指標(biāo)。目前，用于臨床診斷的人體血漿血管緊張素分析方法主要是放射免疫法和化學(xué)發(fā)光法等。建立高效的免疫學(xué)檢測方法的關(guān)鍵是需要高品質(zhì)的抗體和完全抗原。而眾所周知，血管緊張素是小分子結(jié)構(gòu)，激發(fā)不了動物機體產(chǎn)生抗體，也無法直接應(yīng)用于免疫檢測。因此，需要研究人員提供一種簡單可靠的方法，以獲得一種高效的完全抗原。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的是為了解決上述技術(shù)問題，提供一種制備方法簡單、生產(chǎn)周期短，生產(chǎn)成本低的用于血管緊張素免疫學(xué)檢測免疫原性強的完全抗原。

技術(shù)方案包括下述步驟：

一種血管緊張素完全抗原的制備方法，以血管緊張素為原料，包括以下步驟：

（1）將血管緊張素溶于0.1mol/L鹽酸，載體蛋白溶于0.05MpH9.6的碳酸鹽緩沖液，分別制備抗原溶液和載體蛋白溶液；

（2）將濃度為1mol/L?NaNO₂緩慢滴入抗原溶液A，常溫震蕩反應(yīng)20分鐘，得重氮化溶液；

（3）將重氮化溶液邊震蕩邊滴入載體蛋白溶液中，4℃震蕩反應(yīng)4小時，得反應(yīng)混合物；

（4）反應(yīng)混合物通過超濾、透析或者脫鹽柱處理除去反應(yīng)混合物中未偶聯(lián)的小分子物質(zhì)，緩沖液采用pH7.4的0.01M磷酸鹽緩沖液，得偶聯(lián)物；

得到偶聯(lián)物后采用紫外分光光度計對載體蛋白、未偶聯(lián)的小分子物質(zhì)、偶聯(lián)物在150-400nm之間進(jìn)行掃描，觀察200-300nm之間的特征峰，在同坐標(biāo)下進(jìn)行圖形比對，在偶聯(lián)物和載體蛋白對照濃度相同的情況下，偶聯(lián)物的特征峰與載體特征峰相比發(fā)生明顯偏移，偶聯(lián)成功。

進(jìn)一步，所述血管緊張素為血管緊張素Ⅰ、血管緊張素Ⅱ、血管緊張素Ⅲ或血管緊張素1-7中的任一種，血管緊張素1-7是血管緊張素II脫掉最后一個氨基酸（Phe，苯丙氨酸）的產(chǎn)物。

進(jìn)一步，所述步驟（1）中載體蛋白為含有游離氨基的生物大分子，生物大分子為牛血清白蛋白BSA或者卵清蛋白或者牛丙種球蛋白或者鑰孔血藍(lán)蛋白KLH。

進(jìn)一步，所述步驟（3）中，重氮化溶液中血管緊張素與載體蛋白摩爾比10-20:1。

進(jìn)一步，所述步驟（1）中，制備抗原溶液A為1mg/ml，載體蛋白溶液為5mg/ml。進(jìn)一步，濃度為1mol/L?NaNO₂加入摩爾量與步驟（1）中加入的0.1mol/L鹽酸相等0.1mol/L的鹽酸相等，邊加邊震蕩，滴加完成后常溫震蕩20分鐘，得重氮化溶液。

進(jìn)一步，所述步驟（3）將重氮化溶液緩慢滴加到載體蛋白溶液中，邊滴邊震蕩，滴加完成后4℃持續(xù)震蕩，反應(yīng)4小時，得到反應(yīng)混合液。

將濃度為1mol/L?NaNO₂緩慢滴入抗原溶液，常溫震蕩反應(yīng)20分鐘，得重氮化溶液；脂肪族、芳族和雜環(huán)的一級胺和亞硝酸作用（在強酸介質(zhì)下）生成重氮鹽的反應(yīng)標(biāo)為重氮化（一般在低溫下進(jìn)行，伯胺和酸的摩爾比是：1：2.5），一級胺常稱重氮組分，亞硝酸為重氮化劑，因為亞硝酸不穩(wěn)定，通常使用亞硝酸鈉和鹽酸或硫酸使反應(yīng)時生成的亞硝酸立即與芳伯胺反應(yīng)，避免亞硝酸的分解，重氮化反應(yīng)后生成重氮鹽。重氮化反應(yīng)可用反應(yīng)式表示為：

Ar-NH₂+2HX+NaNO₂--—Ar-N₂X+NaX+2H₂0

附圖說明：

圖1偶聯(lián)物通過分光光度計掃描鑒定圖

1、未偶聯(lián)血管緊張素Ⅰ小分子特征峰????2、載體蛋白BSA特征峰