[發(fā)明專利]一種乳鐵蛋白及乳過氧化物酶的純化方法

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201310602964.9
• 申請日: 2013-11-25
• 公開（公告）號: CN103709246A
• 公開（公告）日: 2014-04-09
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 趙建敏;王建武;王慧敏;李由;付明波;湯波;李寧
• 申請（專利權(quán)）人: 北京濟(jì)福霖生物技術(shù)有限公司
• 主分類號: C07K14/79
• 分類號: C07K14/79;C07K1/18;C07K1/20;C12N9/08
• 代理公司: 北京路浩知識產(chǎn)權(quán)代理有限公司 11002
• 代理人: 王文君

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及蛋白質(zhì)純化，具體地說，涉及一種乳鐵蛋白及乳過氧化物酶的純化方法。

背景技術(shù)

乳鐵蛋白（Lactoferrin，LF）是一種非血紅素鐵結(jié)合蛋白，是轉(zhuǎn)鐵蛋白家族的一員，它與血清轉(zhuǎn)鐵蛋白、卵鐵傳遞蛋白等均有將鐵元素傳遞到血清的功能。除此以外，乳鐵蛋白還具以下重要生理功能：（1）參與機(jī)體鐵代謝，促進(jìn)鐵的吸收和利用，提高鐵劑生物藥的效果并減少其副作用，預(yù)防和治療缺鐵所導(dǎo)致的貧血性疾病；（2）廣譜的抗細(xì)菌活性和抗病毒活性；（3）改善胃腸道功能，促進(jìn)嬰幼兒胃腸道發(fā)育；（4）抗炎癥活性和免疫調(diào)節(jié)功能；（5）抗氧化功能：乳鐵蛋白能通過清除體內(nèi)過多的鐵離子，阻止活性氧自由基形成和機(jī)體氧化反應(yīng)，從而延緩衰老和預(yù)防慢性疾病；（6）乳鐵蛋白還具有抗腫瘤、同多種抗生素和抗病毒藥物協(xié)同作用。其中，乳鐵蛋白的抗菌活性基于兩種機(jī)理，第一是它可以剝奪細(xì)菌中的鐵離子，從而抑制細(xì)菌活性；另一個機(jī)理是乳鐵蛋白直接作用于受感染部位，它所帶的正電荷可以與一些細(xì)菌、病毒、真菌和寄生蟲表面的陰離子分子相互作用，最終導(dǎo)致細(xì)胞裂解。

人乳鐵蛋白（Human?Lactoferrin，HLF）是人乳中重要的免疫功能因子，其含量和生物活性均優(yōu)于其它哺乳動物，因此國內(nèi)外學(xué)者專家對于人乳鐵蛋白的研究較多，分別利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)在不同表達(dá)體系中生產(chǎn)重組人乳鐵蛋白，如：重組人乳鐵蛋白分別在曲霉屬真菌、轉(zhuǎn)基因動物、轉(zhuǎn)基因植物中均有表達(dá)，但相對而言，轉(zhuǎn)基因動物如奶牛和奶山羊表達(dá)的重組人乳鐵蛋白的產(chǎn)量和生物活性均優(yōu)于其它表達(dá)系統(tǒng)，可以大規(guī)模生產(chǎn)重組人乳鐵蛋白，從而開發(fā)以其為主要功能成分的能夠治療缺鐵性貧血、抗菌、抗骨質(zhì)疏松和抗腫瘤等藥物。

乳過氧化物酶（lactoperoxidase，LP）是分泌在乳中的一種氧化還原酶，它具有參與構(gòu)成宿主對抗入侵微生物的天然防御系統(tǒng)，同時還具有抗菌活性、降解各種致癌物質(zhì)及保護(hù)細(xì)胞過氧化的作用。LP可與過氧化氫、鹵化物或類鹵化物(X-、SCN-)一起構(gòu)成乳過氧化物酶體系(LPS)。LP催化氧化鹵化物形成次鹵酸，產(chǎn)物次鹵酸是一種細(xì)胞毒素，能與蛋白質(zhì)交聯(lián)，抑制酶和細(xì)胞因子的活性，因此LP也具有抑菌的功能。

目前，分離純化乳鐵蛋白與乳過氧化物酶的方法主要有離子交換色譜法、疏水互作色譜法、親和色譜法、金屬螯合色譜法、羥基磷灰石色譜法和超濾法。由于離子交換色譜具有低成本、耐酸堿、上樣體積大、較易精確控制條件，適合放大進(jìn)行工業(yè)化生產(chǎn)，而乳鐵蛋白為帶有正電荷的堿性蛋白，因此利用離子交換色譜進(jìn)行分離純化為首選，雖然離子交換技術(shù)有如上許多優(yōu)點(diǎn)，但即便是用最精確的控制條件，僅用離子交換單一的方法也得不到純的蛋白，還需要其它的純化步驟。親和色譜的特異性最佳、純度較高、蛋白生物活性沒有損失，但由于成本高，因此工業(yè)化難度較大。疏水互作色譜需要配置高濃度鹽溶液來稀釋蛋白溶液，因此可能會產(chǎn)生蛋白質(zhì)沉淀現(xiàn)象而造成蛋白質(zhì)的損失，且分辨率差、蛋白純度較低。金屬螯合色譜的原理是基于蛋白質(zhì)與固定金屬的親和作用進(jìn)行分離，且最常用于純化帶有多聚組氨酸標(biāo)簽的蛋白質(zhì)，因此不適合用于乳鐵蛋白的規(guī)模性純化。羥基磷灰石色譜為六棱柱形HAp陶瓷構(gòu)成，可以強(qiáng)力結(jié)合天然蛋白，一旦蛋白發(fā)生變性，這種結(jié)合力迅速降低，所以，在這種支持介質(zhì)上蛋白質(zhì)的保留程度不易預(yù)測。