[發明專利]昆蟲病毒多角體實現外源蛋白高效包裹的方法

有效

• 申請號: 201310595964.0
• 申請日: 2013-11-22
• 公開（公告）號: CN103614417A
• 公開（公告）日: 2014-03-05
• 發明（設計）人: 袁林;郭建軍;楊一兵;魏國汶
• 申請（專利權）人: 江西省科學院微生物研究所
• 主分類號: C12N15/866
• 分類號: C12N15/866;C12N7/01;C12R1/93
• 代理公司: 杭州中成專利事務所有限公司 33212
• 代理人: 金祺

技術領域

本發明屬于生物技術領域，涉及一種對蛋白質進行包裹的方法。

背景技術

昆蟲病毒多角體（polyhedra）是指昆蟲病毒在感染宿主細胞后產生的多面體粒子，其主要用來包裹病毒粒子。它的功能是保護包裹的病毒顆粒免受不良環境的破壞，比如：高溫、干燥、輻射等，以及它對各種蛋白分解酶也有抗性，并且在酸性條件下極其穩定，而在堿性環境下易溶解并釋放出病毒粒子[1]。依據多角體在細胞內形成的部位可以分為核型多角體或質型多角體。近來國內外的研究發現質型多角體可以包裹異源蛋白，比如：Ijiri等人將蛋白激酶C（protein?kinase?C）包裹進入了質型多角體中，并發現包裹型的蛋白激酶C相對于沒有經過包裹的蛋白有更強生物學活性和持續的藥物緩釋效果[2]；被多角體包裹的表皮生長因子（epidermal?growth?factor）不僅藥效延長了，而且其能抵抗高強度的射線破壞[3]；曹翠平等人利用多角體包埋外源蛋白時發現，經過包埋的EGFP蛋白（綠色熒光蛋白）放置2個月后仍能檢測到綠色熒光，而干燥處理30min后同樣能檢測到蛋白活性[4]。這些研究表明多角體是耐酸、抗輻射、抗干燥并具有包裹異源活性蛋白特性的優良載體。

目前國外文獻報道中關于多角體包裹目的蛋白的技術手段多是通過構建兩個重組桿狀病毒，即一個專一表達質型多角體病毒多角體蛋白（包裹蛋白）的桿狀病毒，另一個專一表達目的蛋白的桿狀病毒，通過調節兩種病毒的比例混合感染Sf9昆蟲細胞，再從細胞中分離出多角體。該種方法不適合從昆蟲細胞中收集大量的多角體，由于很多細胞在混合感染的時候只感染了一種病毒，所以會形成較多空多角體，以至于包裹效率低。國內學者主要通過家蠶Bacmid表達系統，采用家蠶本身的多角體蛋白包裹目的蛋白，這種方案產生的多角體量大，并且可以通過家蠶本身生產，但采用家蠶本身多角體包裹的目的蛋白并不專一，其中包裹了大量家蠶病毒粒子，不適合現在國際上通過多角體專一包裹目的蛋白的發展趨勢，也不能應用于現代醫藥蛋白或疫苗抗原的包裹需求。

在細胞內實現多角體對目的蛋白的包裹過程需要一個信號肽蛋白的輔助，目前的技術手段基本上采用在目的蛋白的N端加上一段VP3蛋白N末端42-93個氨基酸或者H1螺旋作為信號肽，由于這些蛋白結構比較大，可能會影響很多目的蛋白的正確折疊過程，造成目的蛋白失去生物學活性。

大多數的生物活性蛋白，如：GM-CSF、干擾素、白介素、亞單位疫苗等，目前主要以注射給藥，治療不方便，也難以長期給藥，由其是養殖場。我們尚未見到利用昆蟲生產多角體包裹藥物方面的研究報道。

上文中涉及的參考文獻如下：

[1]Belloncik,S.and?H.Mori,Cypoviruses.The?insect?viruses,1998:p.337-369.（Belloncik,S.and?H.Mori,質型多角體病毒。昆蟲病毒雜志，1998：p.337-369）。

[2]Ijiri,H.,et?al.,Immobilization?of?protein?kinase?C?into?cypovirus?polyhedra.Journal?of?insect?biotechnology?and?sericology.79(1):p.1-1.（H.;Hamada,N.;Kotani,E.;Mori,H.固定蛋白激酶C到質型多角體上。昆蟲生物技術與蠶學雜志。2010.79(1):p.1-1.）。

[3]Ijiri,H.,et?al.,Structure-based?targeting?of?bioactive?proteins?into?cypovirus?polyhedra?and?application?to?immobilized?cytokines?for?mammalian?cell?culture.Biomaterials,2009.30(26):p.4297-4308.（Coulibalyb,Gento?Nishimura等。基于結構的定點固定生物活性蛋白至質型多角體上并應用固定的化的細胞因子培養哺乳動物細胞培養。生物材料雜志，2009,30（26）：p.4297-4308.）。

[4]曹翠平,郭愛芹等.利用BmNPV多角體包埋外源蛋白的觀察.蠶業科學，2009.35(004):p.790-795。

發明內容

本發明所要解決的技術問題是提供一種多角體高效專一包裹目的蛋白的方法。