[發(fā)明專利]水牛卵泡液多肽組的制備和質(zhì)譜分析方法

有效

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• 申請日: 2013-11-21
• 公開（公告）號: CN103884569B
• 公開（公告）日: 2017-03-22
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 張明;付強(qiáng);黃愉淋;黃德倫
• 申請（專利權(quán)）人: 廣西大學(xué)
• 主分類號: G01N1/34
• 分類號: G01N1/34;G01N1/40;G01N27/64
• 代理公司: 廣西南寧公平知識產(chǎn)權(quán)代理有限公司45104
• 代理人: 楊立華

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于多肽組學(xué)技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種水牛卵泡液多肽組的制備和質(zhì)譜分析方法。

背景技術(shù)

目前，隨著生物學(xué)領(lǐng)域中蛋白質(zhì)組學(xué)研究的深入，研究者們發(fā)現(xiàn)一類由氨基酸組成但又與蛋白質(zhì)不同的物質(zhì)，這類物質(zhì)具有蛋白質(zhì)特性，被稱為多肽。在分類上，10個氨基酸以下組成的肽鏈稱為寡肽，10個氨基酸以上稱為多肽，在科研領(lǐng)域中，分子量小于10KDa的蛋白質(zhì)被劃分為多肽范疇。多肽是生命信息的體現(xiàn)者，各種生理變化和生化反應(yīng)都有多肽參與。體內(nèi)存在有上萬種多肽，幾乎所有的細(xì)胞生命周期都受多肽調(diào)節(jié)，涉及激素、神經(jīng)遞質(zhì)、生殖生理等各個生命研究領(lǐng)域。多肽組學(xué)是研究體液（血液、腦脊液、卵泡液、尿液等）內(nèi)全部多肽的一門學(xué)科，通過多肽分離和質(zhì)譜鑒定技術(shù)精確地識別所有多肽信息，對于明確其前體蛋白質(zhì)和生物來源具有重要的意義，多肽指紋圖譜也逐漸被稱為醫(yī)療領(lǐng)域內(nèi)病理診斷指標(biāo)。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是提供一種水牛卵泡液多肽組的制備和質(zhì)譜分析方法。

為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案：水牛卵泡液多肽組的制備方法，包括以下步驟：

（1）水牛卵泡液離心去除細(xì)胞碎片其他雜質(zhì)，取上清液400μL，按體積比1:4向上清液中添加無水乙腈，沉淀并離心去除高豐度蛋白質(zhì)；

（2）將步驟（1）所得沉淀并去除高豐度蛋白質(zhì)后的樣品轉(zhuǎn)移至30000道爾頓超濾管上層，低溫離心，取超濾管下層溶液；

（3）將步驟（2）所得下層溶液轉(zhuǎn)移至10000道爾頓超濾管，低溫離心，取超濾管下層溶液。

步驟（1）中水牛卵泡液離心采用3000×g離心15min。

步驟（1）中添加無水乙腈后室溫25℃靜置30min，離心去除采用8000×g離心15min。

步驟（2）和（3）中低溫離心采用4℃、8000×g離心30min。

上述水牛卵泡液多肽組的質(zhì)譜分析方法，其特征在于包括以下步驟：

（4）將步驟（3）所得下層溶液真空冷凍濃縮至20微升，用微量碳18反相色譜吸附柱脫鹽處理；

（5）將步驟（4）得到的脫鹽樣品點在基質(zhì)輔助激光解離串聯(lián)飛行時間質(zhì)譜儀的384樣品孔靶上，待點靶樣品干燥后，覆蓋0.5微升芥子酸飽和溶液，氮氣吹干；

（6）在質(zhì)譜中設(shè)置合適的參數(shù)采集多肽組指紋圖譜。

步驟（6）中質(zhì)譜參數(shù)為加速電壓2kV，使用標(biāo)準(zhǔn)品校正儀器質(zhì)量軸和質(zhì)量精確度小于0.3道爾頓；一級質(zhì)譜激光強(qiáng)度為4200，完成一級數(shù)據(jù)采集后，動態(tài)選取20個最強(qiáng)的母離子進(jìn)行二級質(zhì)譜分析，二級質(zhì)譜激光強(qiáng)度為4500，碰撞方式為源內(nèi)誘導(dǎo)裂解。

發(fā)明人針對水牛卵泡液成分復(fù)雜難分析的問題，建立了一種水牛卵泡液多肽組的制備和質(zhì)譜分析方法，先通過合理濃度的乙腈沉淀水牛卵泡液中的高豐度蛋白質(zhì)，可有效去除高豐度蛋白質(zhì)對檢測的干擾，再通過不同孔徑的超濾管多次過濾、截留不同分子量的多肽，能有效富集多肽組樣品；脫鹽處理后，用飛行時間質(zhì)譜儀分析多肽組指紋圖譜，在質(zhì)譜檢測時，通過合適的質(zhì)譜分析條件，能高通量鑒定卵泡液多肽組信息。本發(fā)明精確、高效、費用低，實現(xiàn)了對水牛卵泡液中多肽組的高效制備和質(zhì)譜檢測，其檢測結(jié)果可用于分析成熟卵泡液和未成熟卵泡液中多肽組組分鑒定和差異分析，發(fā)明人據(jù)此發(fā)現(xiàn)了一批與卵母細(xì)胞成熟微環(huán)境卵泡液的生物標(biāo)志物。

附圖說明

圖1是應(yīng)用本發(fā)明獲得的成熟卵泡液和未成熟卵泡液中多肽組表達(dá)模式圖，圖中IMFF：未成熟卵泡液；MFF：成熟卵泡液。

具體實施方式

以下所用的試劑乙腈、芥子酸、水都是色譜純，購自Sigma-Aldrich或Fisher試劑公司；30kDa、10kDa超濾管購自Millipore公司；質(zhì)譜儀中離子化方式是基質(zhì)輔助激光解吸附串聯(lián)飛行時間質(zhì)譜儀（Matrix-assisted?Laser?desorption?ionization，MALDI），質(zhì)譜為應(yīng)用生物系統(tǒng)公司4800型飛行時間質(zhì)譜儀。

實施例1

從屠宰場獲取的水牛卵巢，將卵巢上卵泡按直徑分為2個組：1）未成熟卵泡（直徑<8mm）；2）成熟卵泡（直徑>8mm）。使用注射器抽取水牛卵巢表面卵泡內(nèi)的卵泡液分別收集，并將不同個體的卵巢內(nèi)相同組別的樣品混合，用于消除個體誤差。按以下方法分別進(jìn)行檢測。