[發明專利]一種艾塞那肽的固相片段合成方法

有效

• 申請號: 201310593381.4
• 申請日: 2013-11-20
• 公開（公告）號: CN103613656A
• 公開（公告）日: 2014-03-05
• 發明（設計）人: 張忠旗;王慧;張騰;景山崗;韓彬;楊曉琳
• 申請（專利權）人: 陜西東大生化科技有限責任公司
• 主分類號: C07K14/575
• 分類號: C07K14/575;C07K1/06;C07K1/04
• 代理公司: 西安永生專利代理有限責任公司 61201
• 代理人: 高雪霞

1.一種艾塞那肽的固相片段合成方法，其特征在于它由下述步驟組成：

（1）合成Fmoc-Gly-Pro-Ser(tBu)-Ser(tBu)-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser(tBu)-MBHA?Resin

①合成Fmoc-Ser(tBu)-MBHA?Resin

將Fmoc-Rink?Amide?MBHA?Resin用N,N-二甲基甲酰胺溶脹后，用哌啶與N,N-二甲基甲酰胺的體積比為1:4的混合液脫Fmoc-兩次，加入N,N-二甲基甲酰胺、Fmoc-Ser(tBu)-OH、1-羥基苯丙三唑、苯并三氮唑-N,N,N′,N′-四甲基脲四氟硼酸、N,N′-二異丙基乙胺，在氮氣保護下，常溫攪拌1～3小時，得到Fmoc-Ser(tBu)-MBH?A?Resin；

②合成Fmoc-Pro-Ser(tBu)-MBHA?Resin

將Fmoc-Ser(tBu)-MBHA?Resin用哌啶與N,N-二甲基甲酰胺的體積比為1:4的混合液脫Fmoc-兩次，加入N,N-二甲基甲酰胺、Fmoc-Pro-OH、1-羥基苯丙三唑、苯并三氮唑-N,N,N′,N′-四甲基脲四氟硼酸、N,N′-二異丙基乙胺，在氮氣保護下，常溫攪拌1～3小時，得到Fmoc-Pro-Ser(tBu)-MBHA?Resin；

③合成Fmoc-Gly-Pro-Ser(tBu)-Ser(tBu)-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser(tBu)-MBHA?Resin

按照步驟②的方法向Fmoc-Pro-Ser(tBu)-MBHA?Resin上依次連接Fmoc-Pro-OH、Fmoc-Pro-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Pro-OH、Fmoc-Gly-OH，得到Fmoc-Gly-Pro-Ser(tBu)-Ser(tBu)-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser(tBu)-MBHA?Resin；

（2）合成Fmoc-Lys(Boc)-Asn(Trt)-Gly-COOH

①合成Fmoc-Gly-2-CTC?resin

將2-chlorotrityl?chloride?resin用二氯甲烷溶脹后，加入二氯甲烷、Fmoc-Gly-OH、N,N′-二異丙基乙胺，在氮氣保護下，常溫攪拌1～3小時，得到Fmoc-Gly-2-CTC?resin；

②合成Fmoc-Lys(Boc)-Asn(Trt)-Gly-2-CTC?resin

按照步驟（1）中②的方法，向Fmoc-Gly-2-CTC?resin上依次連接Fmoc-Asn(Trt)-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH，得到Fmoc-Lys(Boc)-Asn(Trt)-Gly-2-CTC?resin；

③切割處理

向Fmoc-Lys(Boc)-Asn(Trt)-Gly-2-CTC?resin中加入切割液，常溫攪拌1～3小時，過濾，將濾液加入冷乙醚中，析出沉淀，得到Fmoc-Lys(Boc)-Asn(Trt)-Gly-COOH；

上述的切割液是三氟乙酸與二氯甲烷的體積比為1:99或2:98的混合液，或者是三氟乙醇與乙酸、二氯甲烷的體積比為2:1:7的混合液；

（3）合成Fmoc-Val-Arg(pbf)-Leu-Phe-Ile-Glu(otBu)-Trp-Leu-COOH

按照步驟（2）中①的方法，向2-chlorotrityl?chloride?resin上連接Fmoc-Leu-OH，得到Fmoc-Leu-2-CTC?resin，再按照步驟（2）中②的方法向Fmoc-Leu-2-CTC?resin?上依次連接Fomc-Trp-OH、Fmoc-Glu(otBu)-OH、Fmoc-Ile-OH、Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Arg(pbf)-OH、Fomc-Val-OH，得到Fmoc-Val-Arg(pbf)-Leu-Phe-Ile-Glu(otBu)-Trp-Leu-2-CTC?Resin，Fmoc-Val-Arg(pbf)-Leu-Phe-Ile-Glu(otBu)-Trp-Leu-2-CTC?Resin按照步驟（2）中③的方法進行切割處理，得到Fmoc-Val-Arg(pbf)-Leu-Phe-Ile-Glu(otBu)-Trp-Leu-COOH；

（4）合成Fmoc-Met-Glu(otBu)-Glu(otBu)-Glu(otBu)-Ala-COOH

按照步驟（2）中①的方法，向2-chlorotrityl?chloride?resin上連接Fomc-Ala-OH，得到Fmoc-Ala-2-CTC?resin，再按照步驟（2）中②的方法向Fmoc-Ala-2-CTC?resin上依次連接Fomc-Glu(otBu)-OH、Fmoc-Glu(otBu)-OH、Fmoc-Glu(otBu)-OH、Fomc-Met-OH，得到Fmoc-Met-Glu(otBu)-Glu(otBu)-Glu(otBu)-Ala-2-CTC?Resin，Fmoc-Met-Glu(otBu)-Glu(otBu)-Glu(otBu)-Ala-2-CTC?Resin按照步驟（2）中③的方法進行切割處理，得到Fmoc-Met-Glu(otBu)-Glu(otBu)-Glu(otBu)-Ala-COOH；

（5）合成Fmoc-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Asp(otBu)-Leu-Ser(tBu)-Lys(Boc)-Gln(Trt)-COOH

按照步驟（2）中①的方法，向2-chlorotrityl?chloride?resin上連接Fomc-Gln(Trt)-OH，得到Fmoc-Gln(Trt)-2-CTC?resin，再按照步驟（2）中②的方法向Fmoc-Gln(Trt)-2-CTC?resin上依次連接Fomc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Asp(otBu)-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fomc-Thr(tBu)-OH，得到Fmoc-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Asp(otBu)-Leu-Ser(tBu)-Lys(Boc)-Gln(Trt)-2-CTC?Resin，Fmoc-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Asp(otBu)-Leu-Ser(tBu)-Lys(Boc)-Gln(Trt)-2-CTC?Resin按照步驟（2）中③的方法進行切割處理，得到Fmoc-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Asp(otBu)-Leu-Ser(tBu)-Lys(Boc)-Gln(Trt)-COOH；

（6）合成Fmoc-His(Trt)-Gly-Glu(otBu)-Gly-Thr(tBu)-Phe-COOH

按照步驟（2）中①的方法，向2-chlorotrityl?chloride?resin上連接Fomc-Phe-OH，得到Fmoc-Phe-2-CTC?resin，再按照步驟（2）中②的方法向Fmoc-Phe-2-CTC?resin上依次連接Fomc-Thr(tBu)-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Glu(otBu)-OH、Fmoc-Gly-OH、Fomc-His(Trt)-OH，得到Fmoc-His(Trt)-Gly-Glu(otBu)-Gly-Thr(tBu)-Phe-2-CTC?Resin，Fmoc-His(Trt)-Gly-Glu(otBu)-Gly-Thr(tBu)-Phe-2-CTC?Resin按照步驟（2）中③的方法進行切割處理，得到Fmoc-His(Trt)-Gly-Glu(otBu)-Gly-Thr(tBu)-Phe-COOH；

（7）合成艾塞那肽

①組裝連接Fmoc-Lys(Boc)-Asn(Trt)-Gly-Gly-Pro-Ser(tBu)-Ser(tBu)-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser(tBu)-MBHA?Resin

將步驟（1）得到的Fmoc-Gly-Pro-Ser(tBu)-Ser(tBu)-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser(tBu)-MBHA?Resin用哌啶與N,N-二甲基甲酰胺的體積比為1:4的混合液脫Fmoc-兩次，加入N,N-二甲基甲酰胺與二甲亞砜、N-甲基吡咯烷酮的體積比為0.5～1:1～2:1的混合液以及Fmoc-Lys(Boc)-Asn(Trt)-Gly-COOH、1-羥基苯丙三唑、苯并三氮唑-N,N,N′,N′-四甲基脲四氟硼酸、N,N′-二異丙基乙胺，在氮氣保護下，常溫攪拌3～4小時，得到Fmoc-Lys(Boc)-Asn(Trt)-Gly-Gly-Pro-Ser(tBu)-Ser(tBu)-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser(tBu)-MBHA?Resin；

②組裝連接艾塞那肽

按照步驟①的組裝連接方法，向Fmoc-Lys(Boc)-Asn(Trt)-Gly-Gly-Pro-Ser(tBu)-Ser(tBu)-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser(tBu)-MBHA?Resin上依次組裝連接Fmoc-Val-Arg(pbf)-Leu-Phe-Ile-Glu(otBu)-Trp-Leu-COOH、Fmoc-Met-Glu(otBu)-Glu(otBu)-Glu(otBu)-Ala-COOH、Fmoc-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Asp(otBu)-Leu-Ser(tBu)-Lys(Boc)-Gln(Trt)-COOH、Fmoc-His(Trt)-Gly-Glu(otBu)-Gly-Thr(tBu)-Phe-COOH，用哌啶與N,N-二甲基甲酰胺的體積比為1:4的混合液脫Fmoc-兩次，得到艾塞那肽樹脂，用質量百分比組成為三氟乙酸83%、苯酚5%、苯甲硫醚4%、水3%、三異丙基硅烷5%的切割液按照步驟（2）中③的方法對艾塞那肽樹脂進行切割處理，得到艾塞那肽粗品，艾塞那肽粗品經反相色譜純化、冷凍干燥，得到艾塞那肽。