[發(fā)明專(zhuān)利]一種區(qū)別鴨圓環(huán)病毒和鵝圓環(huán)病毒的PCR-RFLP方法

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201310591203.8
• 申請(qǐng)日: 2013-11-22
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN103602759A
• 公開(kāi)（公告）日: 2014-02-26
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 萬(wàn)春和;黃瑜;陳紅梅;施少華;傅光華;程龍飛
• 申請(qǐng)（專(zhuān)利權(quán)）人: 福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所
• 主分類(lèi)號(hào): C12Q1/70
• 分類(lèi)號(hào): C12Q1/70;C12Q1/68;C12R1/93
• 代理公司: 福州元?jiǎng)?chuàng)專(zhuān)利商標(biāo)代理有限公司 35100
• 代理人: 蔡學(xué)俊

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于分子生物學(xué)技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種利用水禽圓環(huán)病毒（鴨圓環(huán)病毒和鵝圓環(huán)病毒）Rep蛋白基因序列酶切位點(diǎn)差異區(qū)別鴨圓環(huán)病毒和鵝圓環(huán)病毒的聚合酶聯(lián)反應(yīng)（PCR）-限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性（RFLP）方法。

背景技術(shù)

鴨感染圓環(huán)病毒（duck?circovirus,?DuCV）最早由Hattermann等于2003年報(bào)道。我國(guó)臺(tái)灣學(xué)者Chen等對(duì)2002～2003?年在我國(guó)臺(tái)灣地區(qū)采集的樣品檢測(cè)表明，圓環(huán)病毒檢出率為38.2?%?。傅光華等首先在我國(guó)大陸地區(qū)報(bào)道有鴨圓環(huán)病毒感染，Jiang等有從鴨體內(nèi)檢測(cè)到鴨圓環(huán)病毒的報(bào)道，其陽(yáng)性率為33.29%，并伴有鴨1型病毒性肝炎（DHV-I），?鴨傳染性漿膜炎（RA）和鴨大腸桿菌病（E.?coli）共感染。目前，幾乎所有的品種鴨均見(jiàn)有DuCV感染陽(yáng)性的檢測(cè)報(bào)道。

鵝圓環(huán)病毒(GoCV)最早于1999年由德國(guó)學(xué)者Soike等從患病鵝病理組織中觀察到。病鵝主要表現(xiàn)發(fā)育不良、體重下降、羽毛凌亂等，病理組織學(xué)檢查發(fā)現(xiàn)法氏囊、脾臟和胸腺的淋巴細(xì)胞減少，其中法氏囊病變最明顯，甚至出現(xiàn)整個(gè)囊結(jié)構(gòu)的破壞，并可觀察到嗜堿性的包含體。2001年Todd等根據(jù)BFDV和PCV的Rep蛋白的保守序列設(shè)計(jì)簡(jiǎn)并引物，測(cè)定了GoCV的全基因組序列。2002年中國(guó)臺(tái)灣學(xué)者Chen等應(yīng)用9對(duì)引物分別擴(kuò)增基因組不同片段，測(cè)序拼接后獲得了12株GoCV的全基因組序列，并發(fā)現(xiàn)GoCV基因組序列間存在一定的差異。余旭平等最早在我國(guó)浙江檢測(cè)到鵝圓環(huán)病毒，并對(duì)浙江省鵝圓環(huán)病毒的基因組結(jié)構(gòu)和流行病學(xué)情況進(jìn)行分析。萬(wàn)春和等首次從朗德鵝中檢測(cè)到有GoCV感染，并進(jìn)行全基因測(cè)序。有報(bào)道DuCV和GoCV的ORF-V1所編碼的蛋白（Rep蛋白）核苷酸同源性可達(dá)80.0%以上可設(shè)計(jì)一種引物來(lái)檢測(cè)DuCV和GoCV感染。

目前，已有研究報(bào)道多種鴨病毒性傳染病跨種傳播感染鵝的報(bào)道，如鴨肝炎病毒、番鴨呼腸孤病毒和黃病毒；也有鵝病毒性傳染病感染跨種傳播感染鴨的報(bào)道，如鵝細(xì)小病毒和鵝出血性多瘤病毒感染番鴨和半番鴨等報(bào)道。

目前，有報(bào)道DuCV和GoCV的ORF-V1所編碼的蛋白（Rep蛋白）核苷酸同源性可達(dá)80.0%以上可設(shè)計(jì)一種引物來(lái)檢測(cè)DuCV和GoCV感染，但對(duì)可能出現(xiàn)的跨種傳播仍無(wú)相應(yīng)儲(chǔ)備檢測(cè)方法。本研究針對(duì)水禽圓環(huán)病毒（鴨圓環(huán)病毒和鵝圓環(huán)病毒）Rep蛋白基因差異特征建立區(qū)別鴨圓環(huán)病毒和鵝圓環(huán)病毒PCR-RFLP方法相關(guān)報(bào)道，本發(fā)明的建立可填補(bǔ)國(guó)內(nèi)外相關(guān)領(lǐng)域空白。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的是提供一種利用水禽圓環(huán)病毒（鴨圓環(huán)病毒和鵝圓環(huán)病毒）Rep蛋白基因序列酶切位點(diǎn)差異區(qū)別鴨圓環(huán)病毒和鵝圓環(huán)病毒的PCR-?RFLP方法。該方法能有效區(qū)分鴨圓環(huán)病毒和鵝圓環(huán)病毒感染（或共感染），為水禽健康養(yǎng)殖提供技術(shù)保證。

本發(fā)明根據(jù)鴨圓環(huán)病毒和鵝圓環(huán)病毒基因組中Rep蛋白基因特征，設(shè)計(jì)一組引物能同時(shí)對(duì)鴨圓環(huán)病毒和鵝圓環(huán)病毒進(jìn)行陽(yáng)性擴(kuò)增，根據(jù)鵝圓環(huán)病毒擴(kuò)增PCR產(chǎn)物中有特異性的XhoⅠ酶切位點(diǎn)，而鴨圓環(huán)病毒擴(kuò)增PCR產(chǎn)物中沒(méi)有XhoⅠ酶切位點(diǎn)來(lái)對(duì)建立一種對(duì)鴨圓環(huán)病毒和鵝圓環(huán)病毒進(jìn)行快速檢測(cè)的PCR-RFLP方法。

本發(fā)明采用以下技術(shù)方案：

一種區(qū)別鴨圓環(huán)病毒和鵝圓環(huán)病毒的PCR-RFLP方法，其特征在于包括以下步驟：

（1）提取鴨圓環(huán)病毒和鵝圓環(huán)病毒基因組DNA；

（2）用引物P1和P2同時(shí)對(duì)鴨圓環(huán)病毒和鵝圓環(huán)病毒進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到相應(yīng)的Rep蛋白(replication?protein，復(fù)制蛋白)基因片段；

（3）取PCR產(chǎn)物經(jīng)XhoⅠ酶切后進(jìn)行RFLP分析。

其中，PCR引物需滿(mǎn)足如下要求：

（1）該P(yáng)CR產(chǎn)物需選擇鴨圓環(huán)病毒和鵝圓環(huán)病毒Rep蛋白基因中的保守區(qū)域進(jìn)行設(shè)計(jì)，以便能一個(gè)PCR反應(yīng)能對(duì)鴨圓環(huán)病毒基因組DNA和鵝圓環(huán)病毒基因組DNA均能陽(yáng)性擴(kuò)增；

（2）該P(yáng)CR產(chǎn)物需選擇鴨圓環(huán)病毒和鵝圓環(huán)病毒Rep蛋白基因中的保守區(qū)域進(jìn)行設(shè)計(jì)時(shí)必須跨過(guò)鵝圓環(huán)病毒Rep蛋白基因基因中309位的XhoⅠ酶切位點(diǎn)，以便對(duì)膠回收產(chǎn)物能夠進(jìn)行限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性分析。

根據(jù)以上要求，所述的步驟（2）的擴(kuò)增引物P1和P2的序列為：

上游引物P1：5’-CATGATGGGCAGTGGCTTCCT-3’，

下游引物P2：5’-ACCTCCGTCTTCCAATCA-3’。

其中，所述的步驟（2）PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)膠回收大小為623bp。