[發明專利]一種甘精胰島素前體蛋白的提取方法

有效

• 申請號: 201310590624.9
• 申請日: 2013-11-20
• 公開（公告）號: CN103833828B
• 公開（公告）日: 2017-01-11
• 發明（設計）人: 張鴻;寧榮良;張宏達;封海生;王超;陳小鋒;李利佳;徐軍
• 申請（專利權）人: 廣東東陽光藥業有限公司;宜昌東陽光長江藥業股份有限公司
• 主分類號: C07K7/06
• 分類號: C07K7/06;C07K1/14
• 代理公司: 北京集佳知識產權代理有限公司11227
• 代理人: 趙青朵,馮瓊

本申請要求于2012年11月21日提交中國專利局、申請號為201210475070.3、發明名稱為“一種甘精胰島素前體蛋白的提取方法”的中國專利申請的優先權，其全部內容通過引用結合在本申請中。

技術領域

本發明涉及生物化學領域，具體的說是涉及一種甘精胰島素前體蛋白的提取方法。

背景技術

在糖尿病治療中，胰島素對控制血糖達標、預防并發癥具有不可替代的作用，是目前最為有效的糖尿病治療手段之一。近年來，隨著胰島素技術的發展，開發出了胰島素類似物。其中一種長效胰島素類似物-甘精胰島素，正在被越來越多的醫生和患者接受和使用。

甘精胰島素是一種利用重組DNA技術生產的生物合成人胰島素類似物。它是在人胰島素B鏈羧基末端增加了兩個精氨酸，同時也把A鏈羧基末端A21位置的天冬酰胺替換成甘氨酸，皮下注射后，因酸性溶液被中和而形成的微小沉淀可持續緩慢釋放甘精胰島素，繼之吸收入血也慢，從而產生長達24小時平穩無峰值的可預見的血藥濃度。因此，每天定時皮下注射一次甘精胰島素，即可滿足人體對基礎胰島素的需要，也減輕了患者要多次注射痛苦。在持續改善血糖控制的情況下，甘精胰島素可降低低血糖癥發生率。

制備甘精胰島素的方法通常是利用基因工程技術將甘精胰島素前體基因連接到表達載體上，然后轉化到微生物菌表達系統進行發酵生產甘精胰島素前體蛋白，而后菌體分離提取前體蛋白并酶切處理獲得甘精胰島素。目前常見的微生物表達系統有大腸桿菌表達系統和酵母表達系統。大腸桿菌表達系統產物多為包涵體，相比之下，酵母表達系統無需包涵體變復性的繁瑣及高消耗操作步驟，而且酵母菌營養要求低、生長快、培養基廉價，表達的外源蛋白可分泌到胞外，內源蛋白分泌較少，利于外源蛋白的分離和純化。

提取甘精胰島素前體蛋白是生產甘精胰島素不可缺少的步驟，現階段提取甘精胰島素前體蛋白一般是將發酵液不經預處理，直接離心后收集上清液，菌體被廢棄。但是由于目的蛋白性質不同，有部分的目的蛋白可能存在于廢棄菌體中，直接廢棄將導致獲得的目的產物量大大降低。因此，對特定的目的蛋白發酵液進行預處理，有利于提高產量。發酵液預處理方式有溫度調節、pH調節、絮凝與凝聚等，但大多都用于抗生素預處理，主要目的是提高過濾效果等。以調節pH值為例，現有報道如US6218385發酵液加酸的目的是失活發酵后余留的微生物，防止肉湯自溶和維持相對低的肉湯粘度；CN200610011694.4發酵液加酸的目的是處理細菌的莢膜方便過濾；CN200710026682.3發酵液加酸的目的是使目的蛋白不被活性炭吸附；CN200810233835.6發酵液加酸的目的是防止谷胱甘肽被氧化；CN200910222792.6是發酵離心后得沉淀稀釋加酸輔助溶解納他霉素，但是上述報道中均未涉及甘精胰島素前體蛋白發酵液，而且其加酸的出發點也不是提高蛋白含量。同時人胰島素前體發酵液在離心前經過酸化處理后，其前體蛋白的回收率并沒有明顯提高。此外，其他預處理發酵液的報道也并未涉及甘精胰島素前體蛋白含量的提高。

由此可以看出，現有技術中關于如何在提取過程中提高甘精胰島素前體蛋白含量的報道幾乎沒有。因此，在胰島素生產領域需要提供一種能夠增加甘精胰島素前體蛋白含量的提取方法，從而提高甘精胰島素的生產效率。

發明內容

有鑒于此，本發明的目的在于提供一種甘精胰島素前體蛋白的提取方法，使得該提取方法能夠提高甘精胰島素前體蛋白的含量。

為了實現上述目的，本發明提供如下技術方案：

一種甘精胰島素前體蛋白的提取方法，將甘精胰島素前體蛋白發酵液加酸調節pH值為1-4，而后離心取上清液即得甘精胰島素前體蛋白。

本發明申請人針對現有直接離心去除菌體提取甘精胰島素前體蛋白方法的缺陷，經過深入研究，在離心前用酸調節甘精胰島素前體蛋白發酵液的pH值為1-4，使得發酵液中甘精胰島素前體蛋白含量得到提高，其前體蛋白含量最多增加高達83%。

其中，作為優選，所述酸為鹽酸、冰醋酸、硫酸或磷酸，更優選為鹽酸、磷酸中的一種或兩種以上；所述pH值優選調節為1-3，更優選調節為2。