[發明專利]用于空腸彎曲菌PCR-ELISA檢測的引物組、探針和試劑盒及試劑盒的使用方法

無效

• 申請號: 201310585012.0
• 申請日: 2013-11-20
• 公開（公告）號: CN103667454A
• 公開（公告）日: 2014-03-26
• 發明（設計）人: 唐夢君;高玉時;陳大偉;蒲俊華;張小燕;唐修君;陸俊賢;施祖灝;葛慶聯;顧榮
• 申請（專利權）人: 江蘇省家禽科學研究所;唐夢君;高玉時
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;C12N15/11;G01N33/569;G01N33/543;C12R1/01
• 代理公司: 北京連和連知識產權代理有限公司 11278
• 代理人: 奚衡寶

1.用于空腸彎曲菌PCR-ELISA檢測的引物組和探針，其特征在于，所述上游引物和下游引物以及探針的核苷酸序列如下：

上游引物：hipO?F:?5’-GGGTTTGGGTGGTGCTAAG-3’??????；

下游引物：hipO?R:?5’-Biotin-CCACAACAAGCAAAGAAGCAG-3’?????；

探針：5’-GATGATGGCTTCTTCGGATAG-Dig-3’????????；

所述的下游引物5’端為生物素標記，探針的3’端為地高辛標記????。

2.一種含有權利要求1引物組和探針的檢測試劑盒，其特征在于，還包括有：PCR(DNA)模板、PCR反應液和ELISA反應液。

3.根據權利要求2所述的檢測試劑盒，其特征在于，所述PCR(DNA)模板由增菌培養液培養而成。

4.根據權利要求2所述的檢測試劑盒，其特征在于，所述PCR反應液包括PCR?buffer、MgCl₂、dNTP、Taq酶和超純水。

5.一種空腸彎曲菌PCR-ELISA檢測試劑盒的使用方法，其特征在于，按照以下步驟進行：

??1）?以包被緩沖液（0.05mol/L?碳酸鹽緩沖液，pH9.5）稀釋鏈霉親和素，包被酶標板，100μL/孔，終濃度為20μg/L，37℃過夜，甩干后以含0.5mL/L吐溫20的PBST洗板3次，200μL/孔，每次靜置5min，甩干；

2）以含40mg/L脫脂乳的PBS稀釋魚精DNA，封閉酶標板，200μL/孔，37℃?1h，同上法洗板3次；

3）以PBS將PCR產物做1：50稀釋，取100μL加入孔中，37℃固定1h，洗板4次；

4）以1/6體積SSC和0.1%?濃度SDS溶液稀釋探針（濃度為50pmol/mL），?在96孔板中加入100μL含雜交探針的雜交液，55-60℃反應1h，洗板5次；

5）加入100μL以PBS稀釋的AKP標記的抗地高辛抗體，37℃?1h，洗板5次；

6）加入100μL臨時配制的pNPP顯色液，置37℃避光顯色，最后加入50μL?2mol/L?NaOH終止液；

7）可用肉眼觀察，與陰性對照孔進行比較，hipO基因陽性的孔中顯黃色，而陰性應與陰性對照一致；或用酶標儀檢測，用顯色底物溶液調零，在405nm處測定各孔的吸光值，OD_405nm大于0.17為陽性，小于0.17為陰性。

6.根據權利要求5所述的一種空腸彎曲菌PCR-ELISA檢測試劑盒的使用方法，其特征在于，生成PCR產物的反應步驟如下：

PCR擴增反應體系：10倍PCR?buffer?2.5μL、MgCl₂（25mmol/L）2μL、dNTP（2.5mmol/L）2μL、Taq酶0.25μL、上游引物和下游引物各1μL、模板2μL，超純水14.25μL，反應條件：95℃預變性3min；94℃變性30s，55℃退火30s，72℃延伸30s，30個循環；72℃延伸5min，各物料的用量可同比例放大或縮小。

7.根據權利要求6所述的一種空腸彎曲菌PCR-ELISA檢測試劑盒的使用方法，其特征在于，所述模板的制備步驟如下：取0.5?mL增菌培養液于1.5mL?EP管中，10000?r/min?離心5min，棄上清，加入100μL?超純水，漩渦混勻，100℃水浴20min，立即冰浴10min，12000r/min離心5min，取上清，各物料的用量可同比例放大或縮小。