[發明專利]從蝦夷馬糞海膽體腔液中提取調理素的方法

無效

• 申請號: 201310580435.3
• 申請日: 2013-11-19
• 公開（公告）號: CN103665134A
• 公開（公告）日: 2014-03-26
• 發明（設計）人: 李丹彤;張穎;常亞青;宋堅
• 申請（專利權）人: 大連海洋大學;李丹彤
• 主分類號: C07K14/435
• 分類號: C07K14/435;C07K1/36;C07K1/34;C07K1/16
• 代理公司: 大連非凡專利事務所 21220
• 代理人: 高學剛

技術領域

本發明涉及一種提取調理素的方法，特別是一種從蝦夷馬糞海膽體腔液中提取調理素的方法。

背景技術

蝦夷馬糞海膽(Strongylocentrotus?intermedius)，又稱中間球海膽,棘皮動物門，游走亞門，海膽綱。?蝦夷馬糞海膽原產于日本北海道和俄羅斯的遠東等地沿海，由于其性腺色澤好，味甜，在國際市場上很受歡迎，是日本的海膽類中經濟價值最高的種類之一。該種1989年由大連水產學院從日本引入，其后對其人工育苗及增殖等進行了研究，國內每年的種苗生產量已達億枚以上，目前已成為我國主要的養殖種類。其出口價格高于我國的其他固有的經濟海膽類，發展前進良好。隨著海膽養殖規模的擴大，病害問題也日趨嚴重，這些疾病大都具有傳染性，所以一旦感染就會造成很大的損失。

目前關于無脊椎動物體腔液內調理素分子的研究日益增多，通過對調理素分子作用的檢測，可以深入探究蝦夷馬糞海膽的體內免疫機理，豐富無脊椎動物的免疫學理論。棘皮動物與其他無脊椎動物一樣具有先天性免疫系統，但未發現脊椎動物所具有的獲得性免疫。其免疫應答是由參與免疫反應的效應細胞--——體腔細胞和多種體液免疫因子共同介導的，如凝集素，溶血素和調理素等共同并直接作用于入侵病原體。一般情況下，侵入的病源微生物在被吞噬細胞識別之前，先由一些“宿主分子”所包被，這些“宿主分子”是一種血漿蛋白質，促進吞噬作用，被稱為調理素，這種包被過程就稱為調理作用。簡言之，調理素是在吞噬細胞和病源目標間起橋梁作用的物質，有助于吞噬細胞對病原的識別和黏附。無脊椎動物體內的調理素樣分子也有相似功能。目前，已在貝類、蚯、海星、星蟲動物、海膽海參、昆蟲等無脊椎動物中也存在一些體液因子，可以有助于吞噬細胞的識別，其功能與脊椎動物的調理素功能相似。目前為止已在無脊椎動物中分離出多種調理素樣分子。河蜆(Corbicula?fluminea)和福氏海盤車(Asteria?forbesi)中分別存在分子量為40?kDa和29.5?kDa的調理素樣分子，玉足海參(Holothuria?leucospilota)中存在分子量為20?kDa的調理素樣分子，仿刺參體腔液中存在一種分子量為18?kDa調理素樣分，紫球海膽（S.?purpuratus）體腔液中存在可行使調理素功能的SpC3，分子量為130?kDa。但是現在還沒有針對蝦夷馬糞海膽體內調理素的提取方法出現。

發明內容

本發明是為了解決現有技術所存在的上述不足，提出一種從蝦夷馬糞海膽體腔液中提取調理素的方法。

本發明的技術解決方案是：一種從蝦夷馬糞海膽體腔液中提取調理素的方法，其特征在于：所述的方法按照以下步驟進行：

首先從蝦夷馬糞海膽的圍口膜處抽取海膽體腔液，并在3500-5000r/min的條件下離心10-15min，制得海膽無細胞體腔液；

將海膽無細胞體腔液通過截留分子量為3.5kDa的透析膜進行透析脫鹽，并在4-6℃的環境下于透析緩沖液中透析60h，所用的透析緩沖液為0.01mol／L?的Tris-HCI和0.005?mol／LCaCI₂的混合溶液，pH?8.0，每15h更換一次透析緩沖液，共更換4次；

采用Sephadex?G-200凝膠過濾層析柱進行洗脫，并收集洗脫后的各組分，層析過程中選用CaCI₂-Tris緩沖液洗脫；

將洗脫的各組分經紫外分光光度計在280_nm下測定其中各組分的吸光值，確定峰值，出現峰值一組或幾組即為含有調理素的組分。

本發明同現有技術相比，具有如下優點：

本發明所公開的從蝦夷馬糞海膽體腔液中提取調理素的方法，首次提出從蝦夷馬糞海膽的體腔液中進行調理素的提取，并且確定提取出來的調理素樣分子為一種新的蛋白質；該研究旨在深入探究蝦夷馬糞海膽吞噬細胞的免疫機理，豐富無脊椎動物補體家族和免疫學理論，并為研發安全，高效的新型海膽免疫增強劑提供理論依據。

具體實施方式