[發明專利]補骨脂種子特異性啟動子及其在轉基因植物上的應用

有效

• 申請號: 201310572147.3
• 申請日: 2013-11-18
• 公開（公告）號: CN103602683A
• 公開（公告）日: 2014-02-26
• 發明（設計）人: 楊星勇;康丹;方小艷;謝成建
• 申請（專利權）人: 重慶師范大學
• 主分類號: C12N15/113
• 分類號: C12N15/113;C12N15/84;A01H5/10
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

技術領域

本發明涉及一種通過以分子生物學、基因組學以及功能基因組學為手段克隆補骨脂種子特異性表達啟動子的方法，屬于植物基因工程技術領域。

背景技術

首先，種子中含有豐富的碳水化合物，特別是淀粉、蛋白質及脂肪，為作物的生長提供必不可少的營養成分，同時，我們主要的糧食作物和油料作物如小麥、玉米、油菜等的主要食用部位均為種子，因此，對種子的改造是植物基因工程改良的重要目標。種子特異性啟動子能夠調控外源基因在種子中專一性表達，可按照人們的意愿改進并提高種子中的物質含量，滿足日常需要。其次，種子作為植物的繁殖器官，通常成為動物、昆蟲和微生物最愛的食物，于是在植物萌發過程中，由于此時物理屏障無法發生作用，對病原微生物等的抑制作用則要依賴種子中抗菌化合物的抗性。因此，通過種子特異性啟動子啟動外源抗病基因在種子中的特異性表達，既可以抵御昆蟲、病原微生物的入侵，提高植物的抗病蟲害能力，同時也能保證基因安全。

目前研究的種子特異性啟動子種類繁多，包括種皮特異性啟動子、胚乳特異性啟動子等，為獲得外源基因在種子中特異表達的轉基因植物奠定了基礎。Baumlein等將USP基因上游637bp片段與GUS基因連接后導入擬南芥，發現在轉基因擬南芥中GUS基因在胚特異性表達。Russell連接水稻GluB-1基因啟動子和GUS基因后轉入玉米中發現，GluB-1基因啟動子能夠驅動GUS基因在胚乳外層特異性表達。Qu等將水稻SBE1基因啟動子與GUS報告基因融合導入水稻后發現SBE1啟動子可以控制外源基因在水稻種子盾片中特異性表達。研究種子特異性啟動子，發揮其在植物基因工程中的作用，并通過與傳統育種技術的結合，對選育高產優質的作物新品種具有重要的意義。

基于以上背景如何確定補骨脂種子特異性啟動子，為利用種子特異性啟動子進行作物的改良育種奠定技術基礎是本領域亟待解決的技術問題。

發明內容

本發明提供了一種補骨脂種子特異性啟動子及其在轉基因植物上的應用，通過基因工程的手段，利用種子特異性啟動子來安全有效地提高作物產量以及作物抗病害能力。

本發明的補骨脂種子特異性啟動子，其至少包含SEQ?IDNO.3所示的核苷酸序列。

在本發明的另一方面，還涉及含有上述補骨脂種子特異性啟動子的基因或者是載體。

在本發明的另一方面，本發明還涉及上述補骨脂種子特異性啟動子在制備轉基因種子中的應用，優選的，在制備煙草種子中的應用。

克隆補骨脂種子特異性啟動子的方法一染色體步移技術，以及基因特異性表達的鑒定

具體而言，根據抗菌蛋白Psc-AFP的基因編碼序列設計引物，應用染色體步移技術，克隆得到上游未知啟動子序列，利用生物信息學的方法(數據庫分析：PLACE／Plant?CARE)初步分析其可能具有種子特異性啟動活性，并構建種子特異性啟動子驅動GUS報告基因的植物表達載體，經農桿菌介導，轉入美國煙草，對轉基因煙草進行GUS組織化學染色，確證了該啟動子的種子特異性。其特征在于：

1、根據補骨脂抗菌蛋白Psc-AFP編碼序列的分析，設計TAIL-PCR特異性引物以及簡并引物；

2、設計確定hiTAIL-PCR的反應程序，獲得補骨脂種子特異性啟動子pPscAFP序列，如SEQID?No.1所示；

3、生物信息學的方法(數據庫分析：PLACE／Plant?CARE)分析其可能具有種子特異性啟動活性，如SEQID?No.1所示；

4、構建植物表達載體pBI121-pPscAFP：：GUS；所述的pBI121-pPscAFP：：GUS是指以pPscAFP為啟動子，GUS為報告基因，Nos為終止子，Kan篩選轉基因陽性植株的植物表達載體；

5、通過農桿菌介導法，獲得轉基因煙草陽性植株，通過GUS組織化學染色，證實了補骨脂pPscAFP啟動子的種子特異性啟動活性。