[發明專利]巨大芽孢桿菌亞硝酸鹽還原酶共表達載體及其構建方法

無效

• 申請號: 201310571824.X
• 申請日: 2013-11-13
• 公開（公告）號: CN103614404A
• 公開（公告）日: 2014-03-05
• 發明（設計）人: 周培;馮海瑋;時唯偉;支月娥;劉群錄;陸偉;初少華;孫玉靜;衛星
• 申請（專利權）人: 上海交通大學
• 主分類號: C12N15/70
• 分類號: C12N15/70;C12N15/66;C12N1/21;B09C1/10;C12R1/11
• 代理公司: 上海交達專利事務所 31201
• 代理人: 王毓理;王錫麟

1.一種巨大芽孢桿菌亞硝酸鹽還原酶共表達載體，其特征在于，其核苷酸序列由亞硝酸鹽還原酶大亞基Bm-Nas?D，如Seq?ID?No.1所示，以及亞硝酸鹽還原酶小亞基Bm-Nas?E，如Seq?ID?No.2所示組成。

2.一種pETDuet-1質粒，其特征在于，包含權利要求1中所述的亞硝酸鹽還原酶大亞基Bm-Nas?D和亞硝酸鹽還原酶小亞基Bm-Nas?E。

3.一種根據權利要求1所述的共表達載體的構建方法，其特征在于，首先測定巨大芽孢桿菌全基因組序列作為模板，根據設計出的PCR引物擴增出含有酶切位點亞硝酸鹽還原酶大亞基(Bm-Nas?D)和小亞基(Bm-Nas?E)的基因序列，并依次連接到共表達載體pETDuet-1上，通過菌落PCR技術挑選含有目的基因片段的大腸桿菌DH5α的陽性克隆。

4.根據權利要求3所述的方法，其特征是，所述的依次連接包括：

1）將Bm-Nas?D基因連接到pETDuet-1共表達載體上；

2）將Bm-Nas?E基因連接到pETDuet-1-Bm-Nas?D重組載體上。

5.根據權利要求3或4所述的方法，其特征是，所述的PCR引物由

用于將Bm-Nas?D基因并分別連接到pETDuet-1共表達載體上的

正向引物Nas?D-BamH?I-F:

5'-CGGGATCCATGCAAAAAAAGAAACTCGTATTGAT-3'，以及

反向引物Nas?D-EcoR?I-R:

5'-CGGAATTCTTATGATGTGACAACTGTTTCGAACAG-3'，和

用于將Bm-Nas?E基因連接到pETDuet-1-Bm-Nas?D重組載體上的

正向引物Nas?E-Kpn?I-F:

5'-GGGGTACCATGGTGAATAAAAACATTACAAAAG-3'，以及

反向引物Nas?E-Xho?I-R:

5'-CCGCTCGAGTTATTCCTCAATTAAAAGATACAGCA-3'組成。

6.根據權利要求3所述的方法，其特征是，所述的大腸桿菌DH5α的陽性克隆是指：含有重組表達質粒pETDuet-1-Bm-Nas?B-Nas?C的大腸桿菌BL21(DE3)。

7.一種根據權利要求3-6中任一所述大腸桿菌DH5α的陽性克隆的應用，其特征在于，將其發酵后修復次生鹽漬化土壤。

8.一種涉及上述任一權利要求所述的共表達載體的應用，其特征是，將該共表達載體倒入大腸桿菌BL21(DE3)內，通過加入IPTG進行誘導，使該重組菌表達出具有生物學活性的硝酸鹽還原酶，進而優化發酵條件提高硝酸鹽還原酶的表達量，最終實現酶制劑法修復次生鹽漬化土壤。