[發(fā)明專利]基于親和色譜測(cè)定超分子相互作用解離速率常數(shù)的方法

無(wú)效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201310567416.7
• 申請(qǐng)日: 2013-11-14
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN104634909A
• 公開(kāi)（公告）日: 2015-05-20
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 李海燕;葛靜文;殷憲振;孫立新;張繼穩(wěn)
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 中國(guó)科學(xué)院上海藥物研究所
• 主分類號(hào): G01N30/88
• 分類號(hào): G01N30/88
• 代理公司: 北京金信知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理有限公司 11225
• 代理人: 朱梅;錢程

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及一種基于親和色譜的解離速率常數(shù)的測(cè)定方法，特別是針對(duì)相互作用較弱、較廣泛的超分子相互作用。

背景技術(shù)

超分子一般是兩個(gè)或兩個(gè)以上分子的集合體，藥物與輔料形成的超分子通常是主分子（超分子載體）與客分子（藥物）通過(guò)氫鍵、范德華力等非共價(jià)相互作用形成的分子復(fù)合物。藥物與超分子載體，如環(huán)糊精、冠醚和樹(shù)枝狀聚合物等，形成超分子復(fù)合物后能改善藥物的水溶性、生物利用度和靶向性，在抗腫瘤、抗炎等領(lǐng)域發(fā)揮著重要作用。

主客分子之間的相互作用，即主客體識(shí)別，是超分子發(fā)揮其特殊功能的基礎(chǔ)，不僅是超分子化學(xué)的研究?jī)?nèi)容之一，也是分子間相互作用的集中體現(xiàn)。主客體識(shí)別過(guò)程并非通過(guò)傳統(tǒng)的共價(jià)鍵相結(jié)合，而是依靠分子間非共價(jià)鍵相互作用如：范德華力、靜電力、疏水相互作用和氫鍵等實(shí)現(xiàn)結(jié)合。研究主客分子相互作用，有助于了解和揭示超分子結(jié)構(gòu)與功能的內(nèi)在關(guān)系，對(duì)闡明主客分子間的作用過(guò)程以及從分子水平上闡述超分子增溶、改善生物利用度的作用機(jī)理等方面具有非常重要的理論價(jià)值；同時(shí)對(duì)于以超分子體系給藥的化合物篩選具有重要的實(shí)用價(jià)值。此外，也能為指導(dǎo)設(shè)計(jì)高效、低毒的主分子提供有價(jià)值的信息。但現(xiàn)有超分子相互作用研究大多停留在主分子衍生物合成、超分子表征、制劑制備和體外細(xì)胞活性等，有關(guān)超分子主客體相互作用的動(dòng)力學(xué)研究較少。

主分子H（Host）與客分子G（Guest）所形成的非共價(jià)復(fù)合物H-G的生成與解離，分別可用雙分子速率常數(shù)k_on及單分子速率常數(shù)k_off來(lái)表征。前者也稱為結(jié)合速率常數(shù)k_a，后者也稱為解離速率常數(shù)k_d。

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k_a、k_d又與結(jié)合平衡常數(shù)K_a具有公式（2）所示關(guān)系，已知任意兩個(gè)，都可以求得第三個(gè)。定量測(cè)定k_a、k_d及K_a是研究分子間相互作用的首要內(nèi)容，對(duì)于明晰相互作用的動(dòng)力學(xué)過(guò)程、復(fù)合物的體外體內(nèi)性質(zhì)，以及客分子配體的設(shè)計(jì)和篩選具有重要意義。

研究主客分子間相互作用的方法主要包括離心法、平衡透析法、超濾法、光譜法、質(zhì)譜法、核磁共振法、電化學(xué)分析法、量熱法、生物活性回收和固定化配體法等。其中，固定化配體法中的親和色譜和表面等離子共振技術(shù)，由于設(shè)備精度高，易于自動(dòng)化操作和微量化，近來(lái)受到普遍關(guān)注。其主要原理是將一對(duì)能可逆結(jié)合和解離的主客分子的一方固定，當(dāng)含有另一方的溶液流經(jīng)時(shí)，固定的配基就會(huì)選擇地與其結(jié)合，通過(guò)原位、動(dòng)態(tài)檢測(cè)溶液中分子的量隨時(shí)間的變化規(guī)律，即可給出二者相互作用的熱力學(xué)和動(dòng)力學(xué)參數(shù)。

親和色譜法與表面等離子共振法的區(qū)別在于相互作用的檢測(cè)方式不同。表面等離子共振法是直接檢測(cè)生物傳感器表面的小分子，進(jìn)而根據(jù)信號(hào)強(qiáng)弱變化計(jì)算相互作用參數(shù)，這種信號(hào)強(qiáng)弱與待測(cè)物的大小、濃度和相互作用親和力有關(guān)。對(duì)于小分子或低濃度物質(zhì)，如水溶性差的藥物，檢測(cè)難度較大，準(zhǔn)確性也相對(duì)較差。加入有機(jī)溶劑或增溶劑可以改善難溶性藥物在水中的溶解度，但這些添加劑的加入可能對(duì)測(cè)定結(jié)果有影響。因此，表面等離子共振法研究具有中等～較強(qiáng)親和力的相互作用（K_a>10⁵M^-1）時(shí)，準(zhǔn)確度和重現(xiàn)性較好。但不適合低濃度或難溶性小分子以及較弱或中等強(qiáng)度相互作用的研究。

與表面等離子共振法相比，親和色譜法在檢測(cè)方式上具有獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)，應(yīng)用于相互作用研究時(shí)，并不受檢測(cè)方式的限制。與常規(guī)色譜分析類似，親和色譜可以與多種檢測(cè)器相連，針對(duì)不同性質(zhì)的待測(cè)物，可以選擇紫外、熒光及質(zhì)譜等多種檢測(cè)器。對(duì)于低濃度、水溶性差的待測(cè)物，以及較弱或中等強(qiáng)度的相互作用，親和色譜是準(zhǔn)確測(cè)定其熱力學(xué)、動(dòng)力學(xué)參數(shù)的有力工具。