[發明專利]一種制備癌細胞靶向性仿細胞微囊的方法

有效

• 申請號: 201310566240.3
• 申請日: 2013-11-13
• 公開（公告）號: CN103585133A
• 公開（公告）日: 2014-02-19
• 發明（設計）人: 毛崢偉;張元洪
• 申請（專利權）人: 浙江大學
• 主分類號: A61K9/50
• 分類號: A61K9/50;A61K47/46;A61K47/26;A61K31/704;A61P35/00
• 代理公司: 杭州求是專利事務所有限公司 33200
• 代理人: 韓介梅

技術領域

本發明涉及一種制備癌細胞靶向仿細胞微囊的方法。尤其是利用核酸適配體修飾仿細胞微囊實現癌細胞靶向的方法。

背景技術

藥物載體的靶向性是非常重要的一個概念。藥物載體對癌細胞的特異性識別可以提高藥物在腫瘤組織的濃度，因此可以顯著降低給藥劑量，從而降低對正常組織或者細胞的毒副作用。因此，實現藥物載體的靶向性在藥物傳遞領域具有非常重要的意義。

通常的具有靶向功能的藥物載體主要是使用人工合成的聚合物或天然來源的蛋白質和多糖作為原料，其結構比較簡單。但是往往生物相容性差，較易被人體的免疫系統識別并清除，具有靶向癌組織和細胞能力不強的缺點，這些缺點限制了其推廣與應用。

仿細胞微囊是由細胞膜將囊內空間與囊外空間隔離開來形成的球狀物質。利用細胞松弛素b處理哺乳動物細胞，破壞維持細胞形態的肌動蛋白的組裝，然后在機械剪切的作用下制備仿細胞微囊。

仿細胞微囊作為癌細胞靶向性的藥物載體有諸多優點：一方面是由于微囊表面實質是一層類細胞膜結構，小分子藥物通過氫鍵、疏水相互作用等作用可以包埋在微囊內部或者囊壁上；因此可以有效避免藥物暴釋現象的發生，同時也可以降低藥物分子對細胞的毒害。另一方面，不同于傳統化學修飾的微納載體，仿細胞微囊來源于細胞，因此具有極佳的生物相容性，并且有望降低自體免疫系統的清除作用，具有更好的臨床應用價值。

核酸適配體AS1411是富含G的寡核苷酸，它可特異性地與癌細胞表面的核仁素結合，從而實現靶向功能。之前的實驗證明其可以富集到癌組織和細胞，并抑制癌細胞的增殖。

發明內容

?本發明的目的是提供一種簡便快速制備癌細胞靶向性仿細胞微囊的方法。

本發明的制備癌細胞靶向的仿細胞微囊的方法，包括以下步驟：

1）在培養有人臍帶靜脈內皮細胞的培養盤中加入20μL?濃度為1mg/mL的細胞松弛素b溶液，37℃下孵育30min；磷酸鹽緩沖液洗數次，胰酶消化收集細胞，渦旋處理所得細胞，離心取上清液，得到仿細胞微囊懸液；

2）取1mg步驟1）所得的仿細胞微囊懸液加入到末端修飾有醛基的核酸適配體溶液中，使核酸適配體的濃度為1μg/mL；37℃下孵育4h；離心收集所得微粒，洗滌，得到核酸適配體修飾的仿細胞微囊；

3）取200?μg步驟2）所得的仿細胞微囊加入到鹽酸阿霉素溶液中，使鹽酸阿霉素的濃度為40～200μg/mL，37℃孵育3～24h；離心收集所得微粒，洗滌，得到裝載鹽酸阿霉素的癌細胞靶向性仿細胞微囊。

本發明中，所說的核酸適配體為AS1411，其序列：5’-GGTGGTGGTGGTTGTGGTGGT-GGTGG。

本發明的原理：在仿細胞微囊中加入核酸適配體AS1411溶液，通過適配體所帶的醛基與仿細胞微囊表面蛋白的氨基反應將AS1411接枝到仿細胞微囊表面。再將其與鹽酸阿霉素溶液混合，進行藥物負載。核酸適配體與鹽酸阿霉素分別賦予仿細胞微囊以靶向與殺傷癌細胞的功能。

本發明的有益效果在于：

本發明工藝過程簡單，制備速度快，可控性好，材料來源于天然細胞，具有優越的生物相容性和傳遞性能；利用帶有活性反應基團的核酸適配體分子與仿細胞微囊進行原位反應，節省原料且可通過控制投料比調控微囊表面適配體的密度；得到的仿細胞微囊由于同時具有核酸適配體與鹽酸阿霉素，具有了更好的靶向與殺傷癌細胞的性質。

附圖說明

圖1?為標記有細胞膜紅色熒光探針DiI的仿細胞微囊的熒光照片，微囊分散在磷酸鹽緩沖液中。

圖2是接枝有紅色染料Cy3標記的核酸適配體修飾的仿細胞微囊的熒光照片，微囊分散在磷酸鹽緩沖液中。

圖3是癌細胞靶向性微囊負載鹽酸阿霉素后的熒光照片，微膠囊分散于磷酸鹽緩沖液中。

圖4?是實施例1-3所得的負載鹽酸阿霉素的癌細胞靶向性微囊的載藥量與藥物濃度的關系。

圖5是實施例4-6所得的負載鹽酸阿霉素的癌細胞靶向性微囊的載藥量與孵育時間的關系。

具體實施方式

以下結合實例進一步說明本發明，但這些實例并不用來限制本發明。

實施例1

1）在培養有人臍帶靜脈內皮細胞的培養盤中加入20?μL?細胞松弛素b溶液（濃度為1mg/mL）,37℃下孵育30min后用磷酸鹽緩沖液洗三次，胰酶消化，離心收集細胞；渦旋處理所得細胞1min；離心收集所得上清液即為仿細胞微囊懸液。