[發明專利]昆蟲細胞High Five在培養柞蠶核型多角體病毒中的應用

有效

• 申請號: 201310562776.8
• 申請日: 2013-11-12
• 公開（公告）號: CN103555675A
• 公開（公告）日: 2014-02-05
• 發明（設計）人: 范琦;趙振軍;王林美;葉博;岳冬梅;張波;李樹英
• 申請（專利權）人: 遼寧省農業科學院大連生物技術研究所
• 主分類號: C12N7/00
• 分類號: C12N7/00;C12R1/93
• 代理公司: 大連東方專利代理有限責任公司 21212
• 代理人: 賈漢生;李馨

1.昆蟲細胞High?Five在培養柞蠶核型多角體病毒中的應用。

2.根據權利要求1所述的應用為利用昆蟲細胞High?Five進行柞蠶核型多角體病毒或其重組病毒的感染、增殖；或利用昆蟲細胞High?Five篩選基于柞蠶核型多角體病毒而產生的相關重組病毒。

3.根據權利要求2所述的應用，其特征在于：所述的柞蠶核型多角體病毒或其重組病毒在High?Five細胞中的增殖方法為：

（1）High?Five細胞用完全TNM-FH培養基進行傳代培養至對數生長期，然后制成0.5～1×10⁶/ml細胞懸液，再轉至細胞培養板中，26-28℃培養1～2小時，使細胞密度占培養板的70-80%；

（2）將柞蠶核型多角體病毒或其重組病毒樣品，用昆蟲無血清細胞培養基SF-900^TM?II?SFM，按1:100的體積比稀釋，過濾除菌后獲得柞蠶核型多角體病毒或其重組病毒的病毒液；

（3）將步驟（1）制備的High?Five細胞中的培養基棄去，加入等體積的步驟（2）制備的柞蠶核型多角體病毒或其重組病毒的病毒液；靜置28℃培養箱中1小時；

（4）將步驟（3）制備的病毒液棄去，加入二倍體積的完全TNM-FH培養基，28℃培養72～96小時。

4.根據權利要求2所述的應用，其特征在于：所述的柞蠶核型多角體重組病毒在High?Five細胞中的篩選方法為：

（a）將有重組病毒和野生病毒混合感染的柞蠶蛹體液，用昆蟲無血清細胞培養基SF-900^TM?II?SFM按照1:100的體積比稀釋，過濾除菌獲得無菌病毒液，將無菌病毒液進行10倍梯度稀釋；

（b）分別取步驟（a）制備的梯度稀釋的病毒液感染High?Five細胞，1小時后棄去病毒液，加入等體積的2%的低熔點瓊脂糖，待其凝固后，加入等體積的完全TNM-FH培養基，28℃培養4～5天，顯微鏡下觀察病毒發生情況；

（c）取出上層培養液，選最低病毒濃度感染的細胞孔，用玻璃吸管將個別感染有標記的野生病毒的細胞挑出；將其余的細胞懸浮在細胞培養基中，振蕩離心后取上清，注射感染柞蠶蛹，每頭50～100ul，置22℃條件10～12天，使重組病毒繁殖，用顯微鏡觀察或PCR檢測方法分析篩選病毒的純度。

5.根據權利要求2～4中任一項所述的應用，其特征在于：所述的柞蠶核型多角體重組病毒是柞蠶核型多角體病毒ApNPV-Δph/egfp⁺，或柞蠶核型多角體病毒ApNPV-Δph/Δegfp/Caifn-α⁺。