[發明專利]一種新型β-內酰胺類抗生素合成酶的生產方法

有效

• 申請號: 201310557791.3
• 申請日: 2013-11-11
• 公開（公告）號: CN103695405A
• 公開（公告）日: 2014-04-02
• 發明（設計）人: 劉力強;石晨光;范俊輝;王召業;王歡;武芳;賈娟娟;牛昆;呂娜;楊麗萍;邸勝苗;劉東
• 申請（專利權）人: 華北制藥河北華民藥業有限責任公司
• 主分類號: C12N9/84
• 分類號: C12N9/84
• 代理公司: 石家莊國域專利商標事務所有限公司 13112
• 代理人: 白海靜

技術領域

本發明涉及微生物發酵與酶的純化固定化技術，具體的說是涉及一種新型β-內酰胺類抗生素合成酶的生產方法。?

背景技術

β-內酰胺類抗生素是一類非常重要和常用的抗生素，其療效高而毒性小，是目前治療感染性疾病的主要藥物，在抗生素使用中所占比例很大，也是在抗菌藥物中開發品種最多的一類抗生素，主要包括青霉素類、頭孢菌素類、青霉稀類、單環內酰胺類和β-內酰胺酶抑制劑，其中又以青霉素類、頭孢菌素類為典型代表。?

傳統半合成抗生素主要以化學法合成，青霉素類如阿莫西林，頭孢菌素類如頭孢氨芐等，其在化學合成過程經過混酐、縮合、水解和結晶等工序，由于需要基團保護、工藝路線長，所用部分試劑毒性較大，污染嚴重，其中部分有害物質易在藥物中造成微量殘留。近年來國內外都致力于酶法合成的研究，酶法合成頭孢氨芐有著許多化學法無可比擬的優點，它具有反應條件溫和、工藝操作簡單、無需基團保護、清潔安全等優點。6-APA,7-ACA和7-ADCA的許多酰化衍生物均可用酶法合成（Park?C?B,?Lee?S?B,?Stabilization?of?penicillin?V?Acylase?from?streptomyces?lavendula?by?covalent?immobilization.?J.?Mol.?Cataly.?B:?Enzyme,2000,9:?275-2281）。?

酶法合成內酰胺類抗生素研究的重點是合成用酶活性及穩定性的提高，以及能夠，目前有關內酰胺類抗生素合成酶的研究主要傾向應用于半合成青霉素和頭孢菌素類的工業生產中，用以催化制備高效、廣譜、適用于不同用途的新型β-內酰胺抗生素。該酶一方面可以催化青霉素或頭孢霉素水解，得到半合成抗生素的重要中間體6-氨基青霉烷酸（6-APA）和7-氨基頭孢烷酸（7-ACA）；另一方面可以催化酰化反應由6-APA合成新型青霉素或由7-ACA合成新型頭孢菌素，其中應用較多的半合成抗生素有氨芐西林、阿莫西林、頭孢氨芐、頭孢唑林、頭孢羥氨芐和頭孢克洛。這些抗生素的合成應用最廣的為青霉素酰化酶。?

產青霉素酰化酶的微生物很多，可分為革蘭氏陰性菌（G^-）和革蘭氏陽性菌（G⁺）兩大類，前者有大腸桿菌，嗜檸檬酸克魯沃爾氏菌，雷氏普羅威登斯菌，糞產堿桿菌與無色桿菌木糖氧化屬等；后者有巨大芽孢桿菌與粘節桿菌等。G^-菌產生的青霉素酰化酶通常定位于周質空間，G⁺菌產生的青霉素酰化酶則分泌于胞外。?

β-內酰胺類抗生素合成酶生產的關鍵因素之一是高表達量菌株的獲得。雖然以上已經提?到的產青霉素酰化酶的微生物很多，但是這些原始菌株的表達量一般難以滿足生產上的需求，并且很多需要在培養初期添加苯乙酸誘導表達，而苯乙酸對細菌的毒害比較明顯。為提高菌株的表達量，人們將基因工程技術和大規模培養技術進行有機結合，使得原來無法獲得的許多天然蛋白能夠大量生產。目前，眾多研究者多選用大腸桿菌作為宿主菌，其原因是大腸桿菌結構簡單、遺傳學背景清晰、生長周期短、生長條件清楚，已被廣泛應用于重組蛋白，以及非蛋白的生物分子，如氨基酸等的生產。?

如，楊志建等將糞產堿桿菌青霉素G酰化酶構建重組表達質粒pKKFPGA，pKKFPGA再轉化宿主菌DH5α，所得重組菌不需誘導便能高效表達青霉素G酰化酶，表達量達2590u/L，比野生型糞產堿桿菌表達量高432倍。（楊志建，蔡謹，孫健，袁中一，生物工程學報，2004（5），736-740）。由于酶活偏低，無法進行大規模生產應用。?

任立華以產生青霉素G酰化酶的大腸工程菌株LRN075為研究對象，通過優化培養條件與不同比例的培養基成分，使得菌株在培養36h酶活最高達到22800u/L（任立華，青霉素G酰化酶工程菌培養條件的研究，齊魯藥事，2010（11），651-654）。該酶主要應用在水解頭孢菌素G到7-氨基脫乙酰頭孢烷酸（7-ADCA），酶活為水解活性，未涉及合成活性。?

黃艷紅等從巨大芽孢桿菌CA4098的基因組中，通過PCR方法擴增青霉素酰化酶基因，克隆到PKK223-3質粒中，在E.coli?HB101中得到表達，每克菌體（濕重）酶活為61.8u（黃艷紅，張穎，儲瑞藹，吳祥甫，王應睞，袁中一，巨大芽孢桿菌的青霉素酰化酶基因在大腸桿菌中的克隆和表達，生物化學與生物物理學報，1998（2），107-113）。?