[發明專利]一種細胞膜蛋白質富集純化方法

有效

• 申請號: 201310557138.7
• 申請日: 2013-11-08
• 公開（公告）號: CN104628810B
• 公開（公告）日: 2018-11-02
• 發明（設計）人: 張麗華;方菲;趙群;隨志剛;楊開廣;張玉奎
• 申請（專利權）人: 中國科學院大連化學物理研究所
• 主分類號: C07K1/14
• 分類號: C07K1/14
• 代理公司: 沈陽科苑專利商標代理有限公司 21002
• 代理人: 馬馳

本發明涉及一種細胞膜蛋白質富集純化方法，該方法利用細胞膜表面整合膜蛋白質貫穿于膜雙分子層且細胞膜表面膜蛋白質多發生糖基化修飾的自然特征，通過功能化磁性微球捕獲作為誘餌的細胞膜表面糖基化修飾蛋白質，實現細胞膜與細胞器的分離及細胞膜整合膜蛋白質的高效富集。該方法具有細胞膜與細胞器分離效率高的優點，可對細胞膜蛋白質進行高效分析及表征。此外功能化磁性微球的引入，使該方法具有操作簡便，分離快速且樣品損失低的優點。

技術領域

本發明涉及一種細胞膜蛋白質富集純化方法。

背景技術

細胞膜是細胞內外環境交流的界面，細胞膜蛋白質在細胞內外物質交換、細胞識別與免疫應答信號傳導和調控，以及能量傳遞等方面扮演著重要的角色。在已知的藥物靶標中，大約有70%是細胞膜蛋白質。因此，疾病細胞的過表達細胞膜蛋白質可作為治療用抗體及小分子藥物的蛋白靶標。

然而，目前在PDB數據庫中已經被成功解析的86000多種蛋白質的數據結構中，只有1%～2%的結果與細胞膜蛋白質相關。原因在于細胞膜蛋白質具有豐度低、疏水性強及大部分細胞膜蛋白質存在糖基化與磷酸化等翻譯后修飾造成膜蛋白的微觀不均一性的特性。通過細胞膜與細胞器的分離及細胞膜蛋白質的富集，可以減少樣品的復雜性；同時可提高起始樣品復合物的動力學范圍，從而提高低豐度蛋白的鑒定。因此，如何分離純化細胞膜蛋白質特別是含有跨膜區的整合膜蛋白是細胞膜蛋白質組學研究的難點。

近年來，研究者們利用細胞膜蛋白質的特性發展了許多細胞膜蛋白質的富集方法，包括差速離心法、兩相分配法、抗體免疫磁珠結合法、生物素標記法等。然而，這些方法具有膜細胞器污染嚴重、可用抗體種類少、回收率低等缺點。

細胞表面蛋白糖基化修飾富集方法由于其應用范圍廣、純度高等優勢近年來受到廣泛關注。（Wollscheid,B.,Bausch F.D.,Henderson C.,O’Brien R.,Bibel M.,SchiessR.,Aebersold R.&Watts,J.Nat.Biotechnol.2009(27),378-386.）然而，目前采用該方法研究細胞膜蛋白質的結果都關注于細胞膜蛋白質中的糖蛋白質及糖基化位點的研究，使用該方法應用于細胞膜蛋白質的深度覆蓋的研究并未見報道。本發明集合了細胞表面糖基化修飾蛋白質富集方法可高效完成細胞膜與細胞器分離的優勢及功能化磁性微球操作簡便、分離快速、樣品損失低的特點，發展出一種細胞膜與細胞器分離高效、回收率高、操作簡便的細胞膜蛋白質高純度富集方法。

發明內容

為了克服細胞膜蛋白質提取純度低、膜細胞器污染嚴重等不足，本發明提供一種細胞膜蛋白質富集純化方法，使用功能化磁性微球捕獲作為誘餌的細胞表面糖基化修飾蛋白，以富集及分析細胞膜蛋白質，從而實現細胞膜與細胞器分離并獲得高純度細胞膜蛋白質。該方法選擇性高，此外功能化磁性微球的使用，使該方法具有操作簡便，分離快速且樣品損失小的優點。

為實現上述目的，本發明采用的技術方案為：

（1）細胞膜表面糖基化修飾蛋白的氧化：使用酶消化法、離子螯合法或物理法將培養皿中細胞消化后，向細胞樣品中加入氧化緩沖液（pH為4-7的醋酸鹽與氯化鹽混合緩沖液或磷酸緩沖液）配制的氧化劑（濃度為1-100mM的高碘化物）溶液與細胞反應5min-2h；

（2）細胞膜表面糖蛋白的捕獲：采用氧化緩沖液清洗氧化的細胞樣品去除剩余的氧化劑后，向細胞樣品中加入懸浮于氧化緩沖液的帶有功能化官能團的磁性微球，室溫下震蕩2-24h；

（3）醛基的封閉：采用pH為7-10的三羥甲基氨基甲烷緩沖液清洗捕獲蛋白樣品的磁性微球，將捕獲細胞樣品的磁性微球重懸浮于三羥甲基氨基甲烷緩沖液并孵育5min-2h以封閉經氧化的非細胞膜蛋白質；